逆转录聚合酶链反应的操作步骤

1. 总RNA的提取：见相关内容。

2. cDNA第一链的合成：试剂公司有多种cDNA第一链试剂盒出售，其原理基本相同，但操作步骤不一。现以GIBICOL公司提供的SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis 试剂盒为例。

（1）在0.5ml微量离心管中，加入总RNA 1-5μg，补充适量的DEPC H2O使总体积达11μl。在管中加10μM Oligo（dT）12-18 1μl，轻轻混匀、离心。

（2）70℃加热10min，立即将微量离心管插入冰浴中至少1min。

然后加入下列试剂的混合物：

10×PCR buffer 2μl

25mM MgCl2 2μl

10mM dNTPmix 1μl

0.1M DTT 2μl

轻轻混匀，离心。42℃孵育2-5min。

（3）加入SuperscriptⅡ1μl ，在42℃水浴中孵育50min。

（4）于70℃加热15min以终止反应。

（5）将管插入冰中，加入RNase H 1μl ，37℃孵育20min，降解残留的RNA。-20℃保存备用。

3．PCR：

（1）取0.5ml PCR管，依次加入下列试剂：

第一链cDNA 2μl

上游引物（10pM） 2μl

下游引物（10pM） 2μl

dNTP(2mM) 4μl

10×PCR buffer 5μl

Taq 酶（2u/μl） 1μl

（2） 加入适量的ddH2O，使总体积达50μl。轻轻混匀，离心。

（3） 设定PCR程序。在适当的温度参数下扩增28-32个循环。为了保证实验结果的可靠与准确，可在PCR扩增目的基因时，加入一对内参（如G3PD）的特异性引物，同时扩增内参DNA，作为对照。

（4） 电泳鉴定：行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下观察结果。

（5） 密度扫描、结果分析：采用凝胶图像分析系统，对电泳条带进行密度扫描。