谭蔚泓院士课题组发文：小分子荧光探针应用于癌症成像
据世卫组织估计，到2035年全世界每年将有2400万新癌症病例和1450万癌症相关死亡案例。在与癌症相关的死亡中，如果可以早期诊断出癌症，约30%的人会有获救的希望。因此对癌症早期准确的诊断对于增加治愈癌症和提高癌症存活率的几率是非常重要的。癌症相关生物标志物的临床检测在癌症诊断和治疗方面具有重要意义。
异常的酶活性与癌症的发展有直接的关系，因此在活的癌细胞中识别这些酶的位置和表达水平对于早期癌症诊断监测和治疗具有相当重要的意义。目前，小分子荧光酶探针已成为生物系统中酶活性检测和成像的有力工具，其具有较高的灵敏度、无损快速分析和实时检测的能力。由于其结构上的精确性，许多小分子酶荧光探针可以根据不同的需求而被设计开发出来，例如用于实时跟踪和观察活的癌细胞和活体中的不同种类的酶。
近日，湖南大学张晓兵教授（通讯作者）和谭蔚泓院士课题组在Chem. Soc. Rev.上，发表了题为"Recent Progress in Small-Molecule Enzymatic Fluorescent Probes for Cancer Imaging"的综述。 在这篇综述中，作者总结了针对酶的小分子荧光探针在癌症成像中的发展。文章首先阐述了小分子荧光探针在癌细胞中传感和成像的优势，以及强调了小分子荧光探针在癌细胞酶活性检测和成像中的应用和设计策略。随后，作者讨论了小分子酶荧光探针在临床上的应用和性能，并进一步重点介绍了这个新兴领域的挑战和机会。
图1 基于底物的策略的一般结构机理示意图
1. 小分子荧光酶探针的设计策略
大多数小分子酶促荧光探针都是基于与酶的活性位点包括催化位点和结合位点)的特异性相互作用而设计的。酶具有区分不同底物之间微小差异和催化底物特异性反应的能力。酶抑制剂则是另一种能与高亲和力的酶特异性结合，降低酶活性的分子。根据探针与酶相互作用的机理，将小分子荧光酶探针的设计策略分为底基策略和非底基策略。
通过将底物基团附着到荧光团上产生基于底物的探针，荧光团的光谱特性在酶活性变化后发生改变。在过去的几年里，对底物酶探针进行了有效的研究。大多数的酶探针都是基于这种策略来检测和成像酶的活性。常规的基于底物的荧光探针特征是由两个部分组成:荧光团及其相应的识别组。由于连接物与荧光团之间的化学键不再局限于酰胺键，因此对于荧光团的选择也得到了改善。此后，许多研究报道了自毁型连接子在荧光酶探针设计中的重要性。
非基于底物的酶探针主要依赖于酶及其抑制剂或天然配体的高亲和力。典型的非基于底物的酶探针一般有三种组分：结合基团以共价或非共价方式与酶的活性位点相互作用；防止活性位点周围荧光团的立体位阻的柔性连接器；以及可视化荧光团。
天然配体探针已经充分证明了其显著的优势，然而只有一小部分酶具有特定的天然肽配体，这也限制了天然配体探针的开发。另外，一个有效的抑制剂通常对其目标酶具有很高的亲和力和特异性。因此，当适当的抑制剂与不和靶标相互作用的适当荧光团连接时，就可以开发出高效的、特异的抑制探针用于检测和成像活癌细胞中各种酶活性。
图2 非基于底物的酶探针的策略的一般结构机理示意图
图3 小分子荧光酶探针设计的响应机制
2. 小分子荧光酶探针在癌症成像中的应用
基于上述设计策略，大量的小分子荧光酶探针被有效地设计和构建。此外它们还被广泛应用于生物传感、生物成像以及生物医学诊疗，包括用于水解酶的小分子荧光探针，其中包括磷酸酶、羧酸酯水解酶、糖苷水解酶、蛋白酶以及一些双水解酶特异性小分子荧光酶探针。
这些酶大多与癌症的产生和发展相关。例如磷酸酶是一种结构多样的信号酶，可以从核酸、蛋白质和碳水化合物等不同的基质中除去磷酸基。磷酸酶作为调节多种细胞信号通路的重要分子开关，其异常活动会导致不受控制的增殖、分化、和转移，这些都与许多癌症有关；亦或糖基化修饰常常导致癌细胞中糖蛋白的表达、代谢、功能、特性、稳定性和细胞定位发生改变。
因此，异常的糖基化被认为是癌症的一个标志。在原发性卵巢癌和衰老细胞中都有报道发现β-gal异常聚集，可作为原发性卵巢癌和衰老的重要生物标志物。
图4 碱性磷酸酶（ALP）小分子探针
图5 β-gal探针结构
图6 亮氨酸氨基肽酶探针
另一种是用于氧化还原酶的小分子荧光探针，包括酪氨酸酶、单胺氧化酶、硝基还原酶（NTR）及硫氧还蛋白还原酶等等。酪氨酸酶是一种氧化酶可以控制黑色素生成。该酶主要参与黑素合成的两种不同反应，被认为是黑色素瘤癌细胞的生物标志物。此外，酪氨酸酶的异常水平也可能导致白癜风和帕金森病；NTR是可以将NADPH为电子源，将硝基芳香族化合物还原为相应的胺的一种酶。
在实体瘤中，NTR水平与缺氧程度直接相关。因此，NTR水平的检测可用于评估肿瘤的低氧程度。这种酶的还原被广泛应用于设计低氧靶向和成像荧光探针。
图7 用于酪氨酸酶的小分子荧光探针
图8 NTR探针用于A549肿瘤模型小鼠体内荧光成像
最后一种是用于转移酶例如γ-谷氨酰转移酶（GGT）的小分子荧光酶探针。GGT是一种细胞-膜结合转移酶，能催化γ-谷氨酰基官能团从谷胱甘肽（GSH）等分子转移到氨基酸、肽或水等合适的受体，其在谷胱甘肽的合成降解循环中起着关键作用。由于癌细胞高度依赖半胱氨酸，而GGT介导的细胞外GSH代谢产生半胱氨酸使肿瘤细胞具有生长和生存的优势。
目前已经发现过表达的GGT水平与一些种类的人类癌细胞有关。有研究表明，GGT可能通过调节细胞内氧化还原代谢促进肿瘤进展、侵袭和耐药。因此，GGT可被视为癌症的诊断标志物和治疗靶点。由于GGT在生理和病理过程中的重要作用，因此对生物样品中GGT活性的检测和成像具有重要意义。
图9 GGT响应的分子探针结构
3. 小分子荧光酶探针用于临床应用
光学造影剂来指导肿瘤手术是小分子荧光酶探针最具吸引力的临床应用之一。对于癌症治疗的外科干预，主要的挑战是在细胞水平上确定肿瘤和周围健康组织之间的界限。荧光成像技术是提高肿瘤手术视觉效果的一个快速发展的领域。
最近有一些荧光酶探针被用于这个问题。例如第一个用于临床应用的GGT探针。另外小分子荧光促糖苷酶探针已成功用于腹腔镜和内镜下检测体内转移。这种转移可以在5分钟内观察到，这使得探头不仅可以在术前使用，而且在诊断或手术中遇到可疑病变时也可以使用。
图10 有代表性的医用荧光酶探针的结构
4. 结论与展望
在过去的十年中，小分子酶荧光探针用于癌症成像的研究取得了相当大的进展。小分子荧光探针能够直接检测和成像活癌细胞中酶的异常水平，为癌症诊断和研究癌症发展及治疗过程中酶的功能提供了强有力的帮助。
然而，尽管取得了如此显著的进展，但在将这些探针从研究转化到更实际的临床应用仍存在一些挑战。因为突出的灵敏度和选择性是酶荧光探针的基本要求，而酶荧光探针是准确检测低丰度的酶在癌症早期诊断中所必需的。因此还需要探索一些更加智能的设计策略，以提高新探针的信噪比和灵敏度。
目前小分子酶促荧光探针在肿瘤术中鉴定的临床应用中显示出广阔的应用前景。基于酶荧光探针的成像有助于外科医生在手术过程中准确观察癌症和正常组织之间的边界。影像引导的癌症治疗也将为小分子酶促荧光探针的研究提供未来的发展方向。最后，将小分子酶促荧光探针从学术研究推向临床的一个重要挑战是获得FDA的批准。
为此，功能化PET放射标标记或磁共振成像荧光探针来制造双荧光/PET或MRI探针将是一个有效的方法。酶荧光探针的不断发展及其在癌症细胞、临床前动物模型甚至人类的酶活性成像方面的潜在应用，将有助于提高人们对基础生物学和疾病的理解和认识，并最终改善临床的癌症诊疗。
总之，本文综述了近年来小分子酶荧光探针用于癌症成像的研究领域的进展，包括小分子荧光探针用于检测和成像活癌细胞中各种酶的设计策略和应用以及靶向治疗，也提出了这一领域未来走向临床所面临的挑战和应对思路，为研究小分子酶荧光探针提供了全面详细的介绍和新的见解。
