TGF-β1受体阻滞剂对树突状细胞融合疫苗制备的影响研究
绝大多数肿瘤缺乏特异性抗原,而且肿瘤组织中抗原提呈细胞数量减少、功能低下或缺如。因此应用细胞融合技术将肿瘤细胞和DC融合,融合细胞即包含肿瘤细胞表面的所有抗原,又具有DC的强大的抗原提呈能力和刺激效应细胞免疫能力[1-2]。
转化生长因子-β(TGF-β)超家族生长分化因子是一种具有多功能生物学活性的细胞因子,在调节细胞的生长、分化、凋亡、炎症反应及纤维化中起着重要的作用。Smads蛋白是TGF-β唯一的作用底物,能将TGF-β信号从细胞外传递到细胞核的中介分子,是该信号通路中的关键步骤[3]。
我们将SB-431542加入DC后与panc02融合,来观察其细胞表型的表达及其体外抗肿瘤效应。
1材料和方法
1.1材料和试剂
C57BL/6小鼠购自华西医科大学,小鼠胰腺癌细胞株(panc02)购于上海沪峰生物有限公司,SB-43154217重组粒细胞集落刺激因子(GM-CSF)、重组白细胞介素4(IL-4)、FITC- CD80、FITC-CD86、FITC-CD40、聚乙烯二醇(PEG)、HAT/HT培样液均购自Sigma公司
1.2C57BL/6小鼠的来源与主要特性
1.2.1来源1921年立特(Little)用艾比99拉特洛坡(Abby Lathrop)的小鼠株,雌鼠57号与雄鼠52号交配而得C57BL1937年从C57BL分离出C57BL/6和C57BL/10两个亚系。1985年从Olac引进到中国医学科学院实验动物研究所。
1.2.2主要特性①乳腺肿瘤自然发生率低,化学物质难以诱发乳腺和卵巢肿瘤。②12%有眼睛缺损;雌仔鼠16.8%,雄仔鼠3%为小眼或无眼。用可的松可诱发腭裂,其发生率达20%。③对放射物质耐受力中等;补体活性高;较易诱发免疫耐受性。④对结核杆菌敏感。对鼠痘病毒有一定抵抗力。⑤干扰素产量较高。⑥嗜酒精性高,肾上腺素类脂质浓度低。对百日咳组织胺易感因子敏感。⑦常被认作"标准"的近交系,为许多突变基因提供遗传背景。其主要特点为近交系小鼠,试验结果精度高,可比性好,应激反应均一。
1.3DC的制备[4]
取3只C57BL/6小鼠,颈椎脱臼法处死,在无菌条件下剥离股骨,用DMEM培养液冲洗骨髓腔,冲洗骨髓腔变白,获取骨髓细胞混合悬液,离心去掉上清液,淋巴细胞分离液(按与样本体积1∶3混合)梯度离心15～20min,吸取中间白膜层细胞,调细胞浓度为(2×106)个/mL,培养2h后去除悬浮细胞,加入含IL-4(50~100)ng/mL、GM-CSF(100~150)ng/mL的完全培养基,3d半量换液,补加细胞因子。第6天加入LPS和SB-431542(10mmol/L),不加SB-431542作为对照,第7天收获DC。
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1.4融合疫苗的制备[5]
取生长良好的panc02与DC,调节细胞浓度分别为1×107/mL和1×106/mL,将其按panc02∶DC=10∶1混合离心洗涤弃上清,加入1mL PEG(50%,在37℃水浴中预温),轻吹,使两种细胞均匀混合,加入9mL DMEM培养液终止细胞的融合反应,离心洗涤弃上清,在DMEM完全培养液(10%胎牛血清)培养1d,14d后更换HAT培养液,再7d后更换HT培养液,获取纯净的融合细胞。
1.5细胞表型的检测
取未经SB-431542和经SB-431542培养的融合细胞用荧光素标记抗体,流式细胞仪检测其CD80、CD86、CD40的表达。
1.6观察细胞形态
取DC、非SB-431542组和添加SB-431542组,调节细胞浓度分别为2.5×104/mL、1.5×106/mL、1.4×106/mL,接种于6孔板中,5%CO2孵箱中培养7d,观察细胞形态。
1.7淋巴细胞悬液的制备
取C57BL/6小鼠断头处死,取脾脏碾磨过200目滤膜,制成单细胞悬液,再用淋巴细胞分离液分离混合淋巴细胞,DMEM培养液洗2次,5% CO2培养4h,即为效应细胞。
1.8肿瘤细胞的体外杀伤作用
将效应细胞与SB-431542组融合,非SB-431542组按1∶1均匀混合细胞、5%CO2的孵箱静置培养观察3d;培养结束后将细胞浓度调整为2×105/mL,加入含(2×104/孔)的96孔板,5%CO2孵箱静置培养观察2d;每孔加入5mg/mL MTT各40μL,4h后采取一次翻转法弃掉MTT,然后每孔各加入100μL DMSO,将培养板置于微孔板振荡器上振荡10min,使结晶物充分溶解,酶联免疫检测仪测定光吸收值(A),测定波长570nm、参考波长630nm,空白培养液为对照。按下列公式计算各组对panc02的杀伤率。肿瘤细胞抑制率=(对照孔平均A -实验孔平均A)×100%/对照孔平均A
A570-630 =A570-A630
1.9统计学方法
所得数据以均数±标准差(χ±s)表示,采用两组独立样本t检验SPSS13.0统计软件进行分析,P<0.05认为差异有显著性。
2结果
2.1培养细胞的形态观察
新分离的DCs,呈圆形,胞体小:见封三图1;培养第3天胞体圆,有少许突起:见封三图2;加LPS刺激后,培养第7天,树突状突起明显,出现典型的DCs形态:见封三图3。倒置显微镜下观察可见融合细胞体积增大,细胞呈悬浮生长,细胞形态不规则,多呈圆形,每个DC可融合多枚panc02,融合数值及比例均未见规律性,有少许未融合的DC,体积较小。
2.2细胞表型的检测
经SB-431542培养与未经SB-431542培养的融合细胞组比较,细胞表面的表型的表达显著提高(P<0.01)。见表1。
2.3融合疫苗对panc02体外杀伤作用
SB-431542组激活效应细胞对panc02的杀伤率(73.54±5.70)%,非SB-431542组对panc02的杀伤率(31.23±1.93)%,单纯效应细胞对panc02的杀伤率(20.15±2.65)%。融合疫苗组对panc02杀伤作用与效应细胞比较有显著差异(P<0.01),SB- 431542组与非SB-431542组对panc02的杀伤作用比较有显著差异(P<0.01)。
3讨论
近年来应用细胞融合技术将肿瘤细胞和DC融合,已经成为肿瘤免疫治疗研究的热点,国外学者多采用肿瘤细胞与DC经电穿孔途径融合,观察到DC刺激后续抗肿瘤免疫反应的能力明显增强[6]。国内张坤等[7]成功将通过PEG将DC与胃癌细胞融合,结果表明融合细胞有很好的抗肿瘤效应,孙正[8]等将DC与结肠癌细胞融合,体外实验证明有很好杀伤癌细胞效应。
panc02是来源于C57BL/6小鼠的胰腺导管癌细胞株,已证实panc02接种皮下有很强的致癌能力,并且对临床抗癌药有很高的抵抗力,同时也能高表达TGF-β1[9]。SB-431542是一种小分子TGF-β1受体阻滞剂,对融合细胞的生长、分化、增殖不产生明显影响,它可以阻断Smads的磷酸化及核转移,通过转录水平降低TGF-β1的表达,也可通过抑制TGF-β1的转移浸润,实验证明SB-431542同时也能提高免疫效应细胞的IFN-γ的表达,降低IL-10的表达,抑制血管内皮细胞生长因子及纤维蛋白溶酶原的表达发挥生物学效应,从而具有抗肿瘤免疫作用[10,11]。本实验中,我们发现SB-431542作用于DC融合细胞的培养,融合细胞增殖不明显,细胞数量稳定,流式细胞仪检测融合细胞表面CD80、CD86、CD40较对照组明显升高。
在本部分实验中,我们将胰腺癌细胞、DC通过PEG诱导进行融合,经HAT/HT选择培养系统筛选培养后获得纯净融合细胞,并对融合细胞进行流式细胞仪细胞表型检测。结果提示,加入SB-431542后,融合细胞的细胞表型表达水平显著提高,并且体外实验也表明有很好的抗肿瘤效应。但是,未加入SB-431542对DC疫苗抗肿瘤作用不明显,这与国外的研究结果相似[12],可能是panc02高表达的TGF-β1对DC的作用,其进一步机制尚待实验研究,本实验证实SB-431542作用DC融合疫苗是抗肿瘤的一种有效的手段。
