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蛋白质胰蛋白酶磷酸肽图谱制定实验——固相蛋白消化

2019.3.29

试剂、试剂盒	甲醇 PVP-360（溶于乙酸）50 mmol L 碳酸氢铵 pH 8.0
仪器、耗材	PVDF 膜／硝酸纤维素膜保鲜膜／聚酯薄膜
实验步骤	1. 用 SDS-PAGE 凝胶电泳分离 ³²P 标记的样品，用标准的湿式或半干式蛋白质转移方法将蛋白质转移到 PVDF 或硝酸纤维素膜上。 2. 将膜晾干并用保鲜膜或聚酯薄膜包裹以防止膜与胶片粘连，用荧光墨水做标记（见基本方案步骤 2）, 对 X 射线胶片曝光（放射自显影）。 3. 比对胶片和膜上的荧光标记的位置以确定蛋白质在膜上的位置（见基本方案步骤 3）。 4. 用单边的剃刀刀片割下含有所要的蛋白质的膜条，然后将此膜条切成更小的碎片。将这些含有特定的磷酸标记蛋白的膜碎片装入一个微量离心管中。用契仑科夫计数法对膜碎片的放射性进行定量测定。 5. 加入 500 μl 甲醇重新浸湿膜碎片，用去离子水洗涤膜片数次，然后于 0.5% PVP-360（溶于 100 mmol/L 乙酸）中 37 ℃ 孵育 30 min。 6. 洗膜至少 5 次，每次用 1 ml 去离子水。再用 1 ml 50 mmol/L 碳酸氢铵，pH 8.0 洗 2 次。 7. 加入足够量的 50 mmol/L 碳酸氢铵以能盖住膜碎片（通常为 200～400 μl），加入 10 μg TPCK-胰蛋白酶（10 μl 1 mg/ml 储液），于 37 ℃ 孵育至少 2 h。 8. 再加入 10 μl 1 mg/ml TPCK-胰蛋白酶储液，于 37 ℃ 孵育 2 h。 9. 短暂的旋转振荡，全速短时离心收集管底的液体，上清液转移至新的微量离心管中。用 500 μl 去离子水洗膜碎片，短暂离心，将洗涤液加入前次的上清液中。 10. 在 SpeedVac 蒸发器中冻干，用契仑科夫计数法对洗脱下的 ³²P 标记肽进行定量测定。 11. 在过甲酸中孵育，使肽氧化（见基本方案步骤 15～17）。 12. 加入 500 μl 去离子水，冻干，然后在 TLC 平板上进行电泳（见基本方案步骤 21～31）。展开
注意事项	洗脱液中应当含有 80%～90% 的放射活性。