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分析测试百科网 > 行业资讯 > 技术原理

根据大小分离RNA:乙二醛化RNA的琼脂糖凝胶电泳

2019.9.12

           

实验方法原理 这个方法将乙二醛变性和琼脂糖凝胶电泳结合了起来（从 McMaster 和 Carmichael (1977), Thomas(1983) 的方法修改而来）。RNA 的自动乙二醛化、溴化乙锭染色及电泳缓冲液的修改由 Burnett (1977）提供。
实验材料

RNA 样品 RNA 大小标准参照物

试剂、试剂盒

BFTE 电泳缓冲液 DMSO 乙二醇 乙二醇反应混合物 RNA 凝胶上样缓冲液

仪器、耗材

琼脂糖凝胶 水平电泳装置 透明尺 水浴

实验步骤

一、材料

1. 缓冲液和溶液

10X BFTE 电泳缓冲液

DMSO

乙二醇

乙二醇反应混合物

RNA 凝胶上样缓冲液

2. 凝胶

琼脂糖凝胶

3. 核酸和寡核苷

RNA 样品

RNA 大小标准参照物

4. 专用装置

水平电泳装置

透明尺

预置到 55℃ 的水浴

二、方法

1. 配制乙二醛变性反应液。在无菌离心管中混合：

RNA（总共 10 μg） 1~2 μl，乙二醇反应缓冲液 10 μl。

2. 盖上离心管的盖子，将 RNA 溶液在 55℃ 放置 60 min, 在冰水中冰浴 10 min, 然后离心 5s，使所有液体沉到离心管底部。

3. 在样品加热过程中，将琼脂糖凝胶装到水平电泳仪的盒子中。加入足够的 1X BPTE 电泳缓冲液，使其没过凝胶约 1 mmol/L。

4. 将 1~2 μl RNA 上样缓冲液加到乙二醛化的 RNA 样品中，然后马上把 RNA 样品加到凝胶加样孔中，留着两边最外面的两个孔不要加样。将 RNA 相对分子质标准参照物加到最外面的孔中。

5. 以 5 V/cm 的电压进行电泳，直到溴酚蓝迁移大约 8 cm。

6. 将凝胶放在保鲜膜上，在紫外灯下观察 RNA。把透明尺和凝胶对齐，在紫外灯下拍照。

7. 在照片上量出从加样孔到各 RNA 条带的距离。以 RNA 片断大小的对数（log10）值对迁移的距离作图。用得到的曲线计算点杂交检测到的 RNA 的大小。

8. 用上行或下行毛细管转移法把 RNA 固定在固体支持物上。

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