5. circ_104075可以结合miR-582-3p

作者首先想到circRNA通过海绵作用吸附miRNA，直接调控靶蛋白的表达，作者利用miRanda数据库预测了circ_104075最有可能结合的5个miRNA，接着通过RNA pull down技术（云序生物提供此项实验）捕获复合物后RT-qPCR检测发现只有miR-582-3p存在结合；通过构建突变形式circ_104075和miR-582-3p，荧光素酶报告基因实验证实了WT circ_104075和WT miR-582-3p的结合，WT miR-582-3p可以抑制WT-、Mut1-和Mut2- circ_104075的酶活性，而抑制不了Mut3 circ_104075的酶活性，提示circ_104075该结合位点的5’和3’端序列对于miR-582-3p的结合至关重要。同时Mut miR-582-3p则无法抑制circ_104075的酶活性。

图5. circ_104075直接结合miR-582-3p

6. miR-582-3p可以靶向结合YAP-3’UTR

已经证实了circ_104075可以结合miR-582-3p，同时circ_104075与YAP表达成正相关，那么问题来了，miR-582-3p是否靶向调控YAP表达呢？进一步研究证实了miR-582-3p表达与YAP表达的负相关性， 通过预测发现miR-582-3p的5’端可以结合YAP mRNA 的3’UTR的三个位点，对这三个位点进行突变后进行荧光素酶报告基因实验，发现miR-582-3p无法抑制Mut1-YAP-3’UTR，说明YAP mRNA 的3’UTR（315-321碱基序列）对于miR-582-3p的5’端的结合很重要；通过敲低circ_104075后抑制miR-582-3p，证明了miR-582-3p在circ_104075促进YAP表达过程中发挥着重要作用。

图6. YAP-3’UTR是miR-582-3p的靶点

7. YAP-3’UTR的m6A修饰水平促进miR-582-3p的结合

通过MeRIP-qPCR（云序生物提供此项实验）检测到了P1-YAP-3’UTR (235-419 碱基序列)的表达上调，而该区域对于miR-582-3p的结合也很重要。YAP-3’UTR （235-419区域）中的353-357区域存在m6A motif（RRACU）——AGACU，通过突变这位点碱基后过表达进行MeRIP-qPCR，发现只有不突变最后三个碱基ACU的YAP-3’UTR的m6A修饰水平不会降低。同时荧光素酶报告基因实验也证实了YAP-3’UTR 353-357区域的AGACU对于miR-582-3p结合后发挥抑制功能来说是至关重要的。临床组织样本的MeRIP-qPCR也证实了HCC患者组织的YAP-3’UTR 353-357区域的m6A修饰水平明显降低，与HCC患者的YAP表达上调存在一致性。

图7. YAP-3’UTR中的m6A修饰促进了其与miR-582-3p的相互作用

8. circ_104075在HCC中的临床诊断意义

通过对一系列消化系统疾病的分析发现，相对于其他消化系统癌症， circ_104075在HCC患者血清中高表达是具有特异性的，并且随着HCC的进展呈现正相关性，同时手术治疗后HCC患者血清中的circ_104075表达水平明显降低；ROC曲线分析发现，相对于HCC中其他一些应用的生物标志物来说，血清circ_104075表达水平具有更高的敏感性和特异性，提示其可作为诊断HCC的生物标志物从而应用于临床中(云序生物提供环状RNA实时定量PCR服务)。

图8. 血清circ_104075可作为HCC诊断的生物标志物

综上所述，该研究阐明了circ_104075在HCC中上调的机制以及其下游调控HCC肿瘤发生的机制。并且揭示circ_104075可以作为一种新的肝癌诊断生物标志物和治疗靶点。