从 2013 年 1 月份开始到现在，近 2 年的时间里，CRISPR/Cas9 技术的应用领域被来自全球优秀的科学家们不断的扩大。其中包括基因敲除，定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位和 CHIP 等多个领域，而且这个技术的应用领域还在不断的被扩大。

吉锐生物基于多年的基因重组经验（系统的研究过 ZFN / IOS / TALEN / CRISPR 重组技术），以及采用 CRISPR/Cas9 技术构建超过 50 多个株系的经验，重点谈一谈构建敲除细胞株系时，如何利用好 CRISPR/Cas9 技术。

相比于其它重组技术，使用 CRISPR/Cas9 技术做基因敲除是效率最高，成本最低的技术。其中的关键因素无异于下面几点：

1) 明确需要敲除的基因序列

首先需要明确内含子和外显子序列；可以登录 NCBI 或者 UCSC 的网站可以方便的查到；

2) 合适的靶位点选择

一般建议设计 2-3 条，然后转染到细胞中，用 Cruiser™ 和测序的方法验证哪个靶位点的活性最好；也可以登录 CRISPR/Cas9 敲除载体库：（查看载体库详细页） 看看是否有自己要研究的基因，这个载体库中的靶位点都是在细胞体内经过活性验证，保证敲除活性的；

3) 敲除载体选择

根据需要可以选择空载体，带抗性的载体（Puro/Neo），带荧光标记的载体（EGFP/RFP），双敲除载体等。其中空载体较小（8K），可以提高转染的效率；抗性便于后面进行抗性筛选，荧光标记的载体便于进行流式分选；

4) 单细胞生长

不同的细胞单个细胞的生长情况不一样。有的细胞长的快，有的细胞长的慢，有的单个细胞几乎就不长。这个就需要采取不同的方案了，这里推荐一个单细胞培养的小耗材：Cell   Plaza™。设计精巧，采用的是共培养的原理，如果碰到不好长的单个细胞，可以试一试。同时，这个对于植物细胞做敲除时的小愈伤的生长很有帮助。从事植物基因敲除方向的研究人员，也可以试一试；

5) 阳性克隆筛选

关于这个部分可以参考吉锐生物自主研发的产品——Cruiser™ 基因敲除检测试剂盒。它能简便高效的检测基因敲除效率和基因多态性，尤其适用于 ZFN、TALEN 和 CRISPR/Cas9 实验中混合样本的突变效率的检测以及阳性克隆的筛选。可谓阳性克隆筛选的不二选择。

除了敲除外，CRISPR/Cas9还可以应用在定点突变，定点整合，基因沉默，基因定位等各个方向，每个方向都有不同的细节需要把握。这里就不一一阐述。