总cDNA探针的同位素随机标记及点杂交
实验概要
本实验方法介绍了总cDNA探针的同位素随机标记及点膜杂交技术。
实验步骤
1. 总cDNA探针的同位素随机标记
参照Promega公司试剂盒说明书提供的实验流程进行。
1) 将除Klenow大片段外的所有药品，在冰上溶化；
2) 取25ng总cDNA作为模板，100℃，l0min，立即冰上冷却；
3) 在Ep管中加入下列成分：
5X标记buffer 10ul
未标记dNTP混合物(dTTP，dCTP，dGTP) 2ul
变性的cDNA模板 10ul(25ng)
nuclease-free BSA 2ul
(α-32P)dATP 3ul
DNA polymerase (klenow frament) 1ul
nuclease-free water 补足50ul
4) 轻轻混合，37℃，1h；
5) 加热95-100℃，2min，终止反应，冰上待用；
6) 杂交前，100℃，煮沸10 min。
2. 点膜
1) PCR产物定量成相同浓度，按1/10，1/100，1/1000三个梯度稀释；
2) 样品中加入0.4N NaOH，等体积与PCR产物混合，变性30 min；
3) 各取1ul点到膜上，自然晾干；
4) 120℃烤膜，30min。
3. 杂交
1) 杂交前，将尼龙膜在6 X SSC中浸透后，转入预杂交液中，65℃下预杂交1-2hr；
2) 倒掉预杂液，加入变性的32P标记的总cDNA探针，65℃下杂交16-20 hr；
3) 分别使用高盐buffer(2 X SSC和0.5%SDS)和低盐buffer(0.1 X SSC和0.5%SDS)下，65℃洗膜至合适强度；
4) 晾干后，用x-光胶片进行放射自显影；
5) -70℃曝光1-4天后，按常规洗片。
