CRISPR 技术进行细胞 TP53 基因敲除
实验原理
TP53 是重要的抑癌基因。在多种肿瘤中都能发现 TP53 基因突变及功能丧失。我们将针对 TP53 基因设计的靶点构建到 pCas9/gRNA1 载体，转染 293T 细胞，构建了 TP53 基因敲除 293T 细胞系。
1、本实验基因敲除原理：pCas9/gRNA1 载体表达 gRNA 和 Cas9 蛋白。将靶点序列克隆到 pCas9/gRNA1 载体上，gRNA 将诱导 Cas9 蛋白对靶点 DNA 进行切割，造成 DNA 断裂。细胞通过邻端连接 ( nonhomologous end-joining) 修复重新连接 DNA，造成靶点附近 DNA 序列缺失突变。
Cas9 切割原理:
2、pTYNE 载体靶点验证原理：将包括靶点在内的大约 200bp 基因组序列克隆到 pTYNE 载体。构建好的 pTYNE 载体与 pCas9/gRNA1 基因敲除载体共转染 293T 细胞。如果靶点有效，基因敲除载体对 pTYNE 载体载体切割，经过细胞修复后 pTYNE 上移码突变的 EGFP 基因得到修复，发出绿色荧光。
3、阳性细胞筛选原理：pCas9/gRNA1 载体本身不带筛选标签。我们用带有嘌呤霉素和 EGFP 标签的载体 pLV-EGFP（2A)puro 和 pCas9/gRNA1 载体共转染，再用嘌呤霉素筛选转染成功的细胞。
简要步骤
设计靶点→构建 pCas9/gRNA1 载体→pTYNE 验证靶点→pCas9/gRNA1 载体转染 293T 细胞→挑选培养细胞克隆→测序验证基因敲除
靶点设计和基因敲除载体构建
人 TP53 基因有多个 mRNA 和蛋白拷贝，2 个转录起始位点，以及多个翻译位点。我们在 TP53 基因的第四外显子设计了 2 个 CRISPR 基因敲除靶点，以实现对所有 TP53 蛋白的编辑。
靶点序列 1：acctgccctgtgcagctgt
靶点序列 2：ttgattccacacccccgcc
将靶点 1 和靶点 2 构建到 pCas9/gRNA1 载体，获得针对 TP53 基因的 gRNA 基因敲除载体 pCas9/gRNA1-P531 和 pCas9/gRNA1-P532。构建方法同 pCas9/gRNA1 使用说明中的方法。
靶点验证
1、pTYNE-53 验证载体构建
为了验证基因敲除靶点的效率，我们把 TP53 第四外显子部分序列通过 XhoI、HindIII 酶切位点连接到 pTYNE 载体，通过 pTYNE 载体验证靶点的切割效率。构建完成的载体命名为 pTYNE-53。
构建完成后 pTYNE-53 载体序列：
注： 黄色：CMV promoter；灰色：TP53 第四外显子部分序列；绿色：EGFP 序列；下划线：CRISPR 靶点
2、用 pTYNE-53 验证靶点
1) 转染前 24 小时将 293T 铺到 24 孔板中。同时准备 3 个孔。
2) 按照下列体系制备 2 个质粒稀释液
组 1（阴性对照） 组 2（靶点一） 组 3（靶点二）
pTYNE-53 0.4ug pTYNE-53 0.4ug pTYNE-53 0.4ug
pCas9/gRNA1 空载体 0.4ug pCas9/gRNA1-P531 0.4ug pCas9/gRNA1-P532 0.4ug
DMEM 培养基 X ul DMEM 培养基 X ul DMEM 培养基 X ul
总体积 50ul 总体积 50ul 总体积 50ul
3) 准备转染试剂稀释液：
Polyfect-V 转染试剂 4.8ula
DMEM 培养基 145.2ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取 50ul 转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育 15 min。
5) 将转染液加入 293T 细胞。
6) 48 小时后检测 EGFP 荧光表达。
检测结果显示靶点一和靶点二均有效果，靶点一的效果优于靶点二。
TP53 基因敲除 293T 细胞筛选
实验步骤
1) 转染前 24 小时将 293T 铺到 6 孔板中。
2) 按照下列体系制备质粒稀释液
pCas9/gRNA1-P531 0.7ug
pLV-EGFP（2A）puro 0.1ug
DMEM 培养基 X ul
总体积 50ul
3) 准备转染试剂稀释液：
Polyfect-V 转染试剂 1.6ul
DMEM 培养基 48.4ul
4) 将质粒稀释液和转染试剂稀释液分别混匀。取 50ul 转染试剂稀释液分别加入两组质粒稀释液中，充分混匀，室温孵育 15 min。
5) 将转染液加入 293T 细胞。
6) 48 小时后加入 puromycin 至终浓度为 3ug/ml。
7）筛选 3 天后消化细胞，用有限稀释法将细胞接种到 394 孔板，标记单个细胞的孔，做单克隆细胞培养。培养时不加 puromycin。
8）约 7-10 天，细胞形成克隆。消化细胞，将部分细胞继续培养，部分细胞提取基因组 DNA 检测 TP53 基因敲除结果。
克隆检测结果
以细胞克隆提取出的基因组 DNA 为模板，PCR 扩增 TP53 第 4 外显子基因序列，并测序。
测序的 20 个克隆结果如下：
单敲除细胞克隆 12 个
双敲除细胞克隆 2 个
未突变细胞克隆 6 个
合计 20 个
