一次封城时期的新冠毒株测序纪实
1月26日，湖北省疾控中心成功从一名武汉市本地肺炎患者的肺泡灌洗液样本中分离获得一毒株；随即利用Illumina测序技术展开对毒株全基因组序列测定工作，文库制备、上机测序与数据比对分析一气呵成。这一系列工作为湖北省新冠疫情防控、病毒变异监测奠定了坚实基础。随着更多毒株分离与测序，将为揭示病毒传播途径与追溯源头提供重要的科学依据。那么在这个毒株测序背后发生了什么呢？
1月10日
湖北省疾控中心生物安全三级实验室获国家卫健委批复，着手开展新冠病毒分离工作。
1月20日
得知省疾控测序仪尚未就位，疫情危急，深知病毒基因组数据对于疫情防控的重要意义。Illumina迅速调配一台iSeq样机，由北京发往武汉，支援测序。
图1：Illumina iSeq样机
同时，来自Illumina技术支持团队两位资深应用专家（FAS）、市场部专家以及与友商微未来成员共同组建成一个由7人组成的 “湖北CDCnCoV测序支持小分队”，全力协助中心毒株测序工作。
1月21日
根据病毒分离进展情况，“小分队”会商决定采取TruSeq Stranded Total RNA联用Nextera XT的建库方案。两位FAS开始着手组织技术手册和参考资料，为毒株测序重新制定了一套建库方案，对关键步骤进行优化。
图2：本次毒株测序建库方案
1月26日
毒株分离成功。病毒培养物的Real-Time RT-PCR检测结果Ct值为10，提示样品中病毒基因组拷贝数极高，符合建库要求。
1月27日
省疾控老师从繁重检测任务中抽身，全身心投入基因组测序实验；在FAS协助下开始实验前准备，对测序仪及实验相关用品做逐一清点、校验，顺利点亮iSeq。一切就绪。
图3：测序前准备就绪
1月28日
上午9时
建库正式开始，经核酸提取、反转录与接头连接、文库纯化一系列操作，核酸定量结果表明最终文库产物浓度属于正常范围，提示建库成功。
省疾控老师从Genebank直接下载2019-nCoV全基因组序列（MN908947.3）作为参比基因组直接导入iSeq，并通过Local Run Manager设置了本地重测序（Resequencing）分析程序。
晚22时
测序反应顺利启动。当测序试剂盒缓缓收入仪器内的一瞬间，整个”小分队”心情既激动又紧张。
图4：新冠分离株全基因组测序覆盖度
出自iSeq预装local run manager测序报告
1月29日
下午16时
顺利下机。PE150条件下，产出PF Reads 6M，Q30质量数据占93%。Local run manager自动启动参考基因组比对分析程序。16:45分，老师反馈测序结果，病毒分离株基因组全长29,847nt，平均覆盖度4,805；经与CLC Genomics Workbench、微未来nCoV基因组测序分析软件平行验证，比对结果完全一致。至此，毒株基因组测序实验顺利完成。
图5：Illumina冠状病毒测序全流程解决方案
（病毒示意图与亲缘进化关系图来自网络）
事后几位主要当事人如是说
省疾控老师：Illumina公司提供的建库和测序流程科学又清晰，指导专业又及时；iSeq简单易用。最重要的是，序列测定和结果分析能在仪器上一步完成。我们首例新型冠状病毒的序列测定非常成功，感谢你们的大力支持！
FAS吴老师: 这次微信支持的感受还挺不错，让客户能快速上手一次性顺利完成实验，说明我们的试剂盒表现是很稳定的，同时，增强客户老师测序实验信心和提高了参与积极性，个人觉得客户的体验应该也不错。算是对建库技术支持和培训方式的一种新尝试。
FAS杨老师：根据Qubit浓度测定结果判断，文库终产量介于3~10ng/μl之间，是正常文库产量。如果超出这个区间，很可能是接头没有去除干净；低于此范围提示接头连接效率问题。根据建库实际情况，纯化磁珠用量按比例调整到0.8（说明书标准用量参考值是0.6），这样优化调整为了保证接头去除更干净，同时尽可能减少文库损失。
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