微核实验在染色体水平检测DN A损伤实验（一）

实验步骤

一、材料

1. 胞质分裂阻滞微核试验

2. 微核的着丝点检测

(1)从硬皮病 C R E S T 亚型的患者中取得的血清样本。

(2) F I T C 标记的兔抗人 I g G 二抗。

(3) 过氧化物酶标记的兔抗人 I g G 。

(4) 二胺基联苯溶液（D A B ): I m g /m L 溶于 0. 5 mol/L Tris 碱缓冲溶液， p H 7. 6。

(5) NiCl2 溶 液 ： 8% 溶液溶于 0.5 mol/L Tris 碱缓冲溶液， p H 7. 6 , 使用前配制。

(6)D A B 反应混合物： I m L D A B 溶 液 ， 3 m L Tris 碱缓冲 溶 液 ， p H 7.6, 25NiCl2 溶液 ， 40 uL 0 •I m o l / L 咪唑水溶液和 10 u L 30% 过氧化氢。使用前配制。

(7)中性红溶液： 0.1 % 溶于双蒸水。

二、方 法

1. 用于分离的人淋巴细胞的标准 CBMN 试验

在这个实验中只有出现在用 P H A 刺激后完成一次核分裂的细胞中的 M N i 才用于分析。这些细胞可通过由在第一次有丝分裂之前加入 Cyt B 使细胞不再进行后续细胞分裂而导致的双核形态来辨认。在优化条件下 P H A 刺 激 后 72 h 在 所 有 活 细 胞 中（除去坏死和凋亡外的所有细胞）双核细胞比例可达 3 5 % 〜6 0 % 或更多。所有实验设备都必须

达到生物安全要求以保护操作者，并且所有在此程序中使用的溶液需经过滤灭菌。

1.1 淋巴细胞的分离、细胞培养和细胞收集

（1）用含有抗凝剂肝素的管子收集新鲜静脉血，置 于 22°C ， 4 h 内分离。

（2）用已灭菌的 0. 8 5 % NaCl 按 I : 1 稀释血液，轻轻颠倒混匀。

（3）将稀释后的血液轻轻覆盖在 Ficoll Paque (Pharmacia) 密度梯度上，所用比例大 约 1 : 3 (例 如 2 mL Rcoll Paque 加 人 6 m L 稀释的血液），小心不要扰动两相界面。

(4)在 22°C 下 400 g■离心 25〜40 min。

（5）淋巴细胞位于 Ficoll Paque 和稀释的血浆之间。收集后在 22°C 加 人 3〜5 倍体积的 HBSS。根 据 体 积 的 不 同 情 况 ，将 所 得 细 胞 悬 液 在 280〜 400 g 下离心5〜IOmin0

（6）弃上清，用 2 〜5 倍 体 积 HBSS 重 悬 细 胞 ，并 根 据 不 同 体 积 用 180〜400 g 离心 5 min。

（7） 弃上清，用 I mL RPMI1640 培养液重悬细胞。

（8）细胞计数计算细胞浓度，根据台盼蓝实验得到的活细胞比例调整细胞浓度。

（9） 用 含 有 1 0 % 〜15% 灭 活 胎 牛 血 清 的 RPMI1640 培 养 液 调 整 细 胞 浓 度 至 0. 5 XIO6〜I .OXlO6 细胞/mL, 并 在 圆 底 的 培 养 管 中（10 m m 宽）用 0.75〜1.0 mL培养液进行培养。

（10）每个培养管中加入 10 ML/mL PHA (Glaxo Wellcome HA1 5 ) 刺激淋巴细胞分裂。将盖拧松， 37°C ， 5 % C0 2, 湿润条件下培养。 P H A 的浓度需根据产品的纯度和来源进行优化，以 保 证 细 胞 在 用 Cyt B 阻滞后产生最大数量的双核细胞。

（11） P H A 刺 激 44 h 后 ，每毫升培养液加人 4.5 pg CytB (戴手套和通风橱内操作）：溶 解 IOOmL Cyt B 储 液 ，加 入 900 培养液，混合。将 75 混 合 液 加 人 1m L ±普养液使终浓度为 4. 5 Mg Cyt B/mL (—些实验室也成功地使用了 6. 0ugC y t B /m L 的浓度）。继续培养。

（12）加入 C y t B 28 h 后用血细胞分离器（cytocentrifuge, ShandonElliot) 收集细胞。弃去 1 〇〇 uL 培养液，将细胞轻轻重悬于管中。将 100 〜120ul 细胞悬液转移至血细胞离心杯（ShandonElliot) , 离心至每玻片产生两个小点（见注释1)。（如下设置细胞离心程序，时间： 5 min，转速： I O O fiO 将玻片从血细胞分离器中移开，空气干燥 1 〇 〜2 〇 m i n, 用 1 0 0 % 甲醇固定 l 0m in 。

（13）用不同的可区分细胞核与胞质界限的方法染色。在我们的实验中使用的是「DiffQuik」，它是一种商业成品，能迅速、优化地给出结果（见注释 1)。

（14） 染色后将玻片晾干并用 D P X 液盖上盖玻片。这一步骤需在通风橱内完成，将片子放在通风橱内储存，直到需要使用。

对照和经遗传毒物处理的细胞培养需有重复样本 ，每个样本都制备玻片。这对实验数据标准差的获取来说是必需的，例如变异系数（标准差），对于每组重复数据都需要标明（ 见注释 2 和 3)。这一实验设计见图 2。

对于突光显微镜，推荐使用吖陡橙（40 ug/mL溶 于 Sorensen』 s 憐酸缓冲液， p H 6 . 9 ) 进行染色。如果没有细胞离心机，可使用下面介绍的用于全血培养的方法准备玻片

1.2 玻 片 的 检 查 以 及 M N 频率的评价

最好用放大 1000 倍的光学显微镜或荧光显微镜观 疲 诚 士 诚 屮 單 女 公 观察玻片。玻 片 最 好 在 分 析 _代 号 标 记 ，这 样 分 析人员不会知道玻片的含义（盲法）。分析数据需两位不同的分析者用相同显微镜对每个重复实验进 行 评 判（ 见注释 4 和 5)。进行统计的细胞数（ 见注 释 6 ) 需根据实验预期检测 M N 指数的变化值和预期的标准差确定。每张玻片需获得

以下信息：

（1）计算至少 1000 个 双 核（ B N ) 细 胞 内 的 微 核（M N i ) 数量以及 M N i 在 1000 个B N 细胞内的频率。在 B N 细胞中计数 M N i 的标准如下。

（2）含有 0、 1 或更多微核（M N i ) 的 B N 细胞的分布；一个双核细胞中的 M N i 数在正常人体淋巴细胞中约为0〜3 个 ，但根据毒物暴露和年龄的不同有时可能大于3 个。

（3）在至少 1000 个 B N 细胞中出现微核的 B N 细胞频率。

（4）统 计 1000 个 B N 细胞中细胞核质桥的频率。在 B N 细胞中计数核质桥的标准如下。

（5） 每 500 个细胞中单核、双核、三核和四核细胞的比例。从此信息可以得出核分裂 指 数（nuclear division index，稍后解释）。

（6）在统计活的单核、双核或多核细胞频率的同时，统计在同张玻片上每 500 个细胞中由凋亡或坏死引起的已死或将死的细胞比例（ 评判标准稍后列出）（ 见注释7)

需要注意的是当无法判断如何对某一细胞进行分类时最好忽略该细胞。一张统计表中应包含的基本信息见表 1。

1.3 分 选 双 核 细 胞 的 标 准 及 微 核 、细胞核质桥、核芽、凋亡和坏死的细胞的计数

（1）双核细胞的分选标准：用 于 M N 频率计算的胞质分裂阻滞的细胞须符合以下特征：

a. 细胞须为双核。

b. 在一个双核细胞的两个细胞核须有完整的核膜，并须在一个细胞质内。

c. 双核细胞中的两个核的大小、染色形状和密度应相似。

d. 在 B N 细胞中的两个核可能由不超过 1/4 核直径的细胞核质桥连接。

e. 在 B N 细胞中的两个核可能相互接触，但是不该重叠。只有在这两个核的界限非常清晰时才能将此种重叠的双核细胞计算在内。

f. 双核细胞的胞质界限或细胞膜必须完整，并能与附近细胞清晰区分。

可以或不可以用于计数的双核细胞的类型如图 3 所示。 在计算微核细胞频率时不应被包括的细胞种类包括单核、三核、四核和多核细胞，以及凋亡或坏死细胞（ 图 4)。

微核计数的标准： M N i 在形态上和核相似，只是比核小。它们还有以下一些

特点：

a. 人淋巴细胞 M N i 直径的大小通常占双核细胞中主核直径的 1/16〜1/3, 其面积相当于主核的 1/256〜1/9。

1.4 核 分 离 指 数 计 算（ N D I ) 以 及 核 分 离 细 胞 毒 性 指 数（ NDCI)

(1)根 据 Eastmond 和 Tucker 的 方 法（3 0 ) 计 算 N D I 。计 数 500 个活细胞，计算含有一个、两个、三个或四个核的细胞频率， N D I 计算公式如下：

N D I = ( M 1 + 2 X M 2 + 3 X M 3 + 4 X M 4)/N

M l 〜M 4 指含有 1〜4 个细胞核的细胞， N 表示总活细胞数。 N D I 指数以及双核细胞的比例是比较淋巴细胞的有丝分裂反应以及测试药物的细胞抑制作用的有效参数。

(2)用于评价核分裂状态的更为准确的方法是将坏死和凋亡的细胞数包含在细胞总数内，因为在高剂量的毒性物质作用下死细胞可能占了很大的比例。所以需要注意的是如果不包括坏死和凋亡的细胞，双核细胞比例和 N D I 指数会偏高。

(3) 下面经修正的公式可用于较为准确地估算核分裂状态以及细胞分裂动力学的情况 ，这个公式考虑了坏死和凋亡的细胞。

NDCI= (A P + Nec+ M l+ 2X M2+ 3 X M3+ 4 X M4) /N*

NDCI: 核分裂细胞毒性指数（nuclear division cytotoxicity index); A p : 调亡的细胞； N e c : 坏死的细胞数； M l 〜M 4 指含有 I〜4 个细胞核的细胞； N *表示总 细 胞 数（ 活细胞和死细胞)。