实验材料 HeLa 细胞

试剂、试剂盒 NaCl 洗液Laemmli 上样缓冲液ATP磷酸肌酸无菌蒸馏水尿素缓冲液MD 0.1MD 0.6KCl 洗液链亲和素琼脂糖凝胶封闭缓冲液NP-40

仪器、耗材 链亲和素琼脂糖凝胶Dounce 玻璃匀浆器微量透析杯透析袋

实验步骤

一、材料与设备

1. AAS 法纯化 RNP

缓冲液应新鲜配制并预冷至 4°C，Pefaloc（Boehringer 公司）及 DTT 在用前加入缓冲液中。

(1) 生物素化的 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸可在普逋 DNA 合成仪上合成，在实验中也可以采用 2'-O-烯丙基 RNA 寡核苷酸代替 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸，这可以降低它与非特异性蛋白质的结合。

(2) 链亲和素琼脂糖凝胶。

(3) 细胞核提取物最好从新鲜培养的 Hela 细胞制备，也可直接从购买的冻存细胞制备。

(4) Dounce 玻璃匀浆器，A 型及 B 型研杵。

(5) 1 ml 微量透析杯（截留分子质景为 12000 Da）。

(6) 100 mmol/L NaCl 洗液（WB 100）：0.1 mol/L NaCl，20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，0.05% NP 40.5 mmol/L Pefablock，0.5 mmol/L DTT。

(7) 250 mmol/L NaCl 洗液（WB 250)：将 WB 100 中的 NaCl 浓度改为 250 mmol/L。

(8) Laemmli 上样缓冲液：10 ml 缓冲液含有 2.4 ml 1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8），3ml 20% SDS，3 ml 甘油，1.6 ml  β 巯基乙醇，0.006 g 溴酚蓝。

(9) 1 mol/L MgCl2。

(10) 1 ml ATP（pH 7.0）。

(11) 0.5 mol/L 磷酸肌酸（pH 7.0）。

(12) 3 L 预冷的无菌蒸馏水。

(13) 8 mol/L 尿素。

(14) 1 mol/L NaCl（WB 1000)：WB 100 中的 NaCl 浓度改为 1 mol/L。

2. AAD 法去除 RNP

缓冲液成新鲜配制并预冷至 4℃，苯甲基磺酰氟（PMSF) 及 DTT 在使用前加入缓冲液中。

(1) 宽度为 10 mm 和 25 mm 的透析袋（截留分子质量为 12000~14000 Da）。

(2) HeLa 细胞及 Dounce 匀浆器 [ 同1“AAS 法纯化 RNP” ] 。

(3) 缓冲液 A：10 mmol/L HEPES ( pH 7.9)，1.5 mmol/L MgCl2，10 mmol/L KCl，1.5 mmol/L DTT。

(4) 缓冲液 S：20 mmol/L HEPES ( pH7.9)，10% 甘油，0.42 mol/L KCl，1.5 mmol/L MgCl2，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT 及 0.5 mmol/L PMSF。

(5) 缓冲液 D：20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，20% 甘油，0.1 mol/L KCl，0.2 mmol/L EDTA，0.5 mmol/L DTT，0.5 mmol/L PMSF。

(6) MD 0.1：含 0.1 mol/L KCl 及 10% 甘油的缓冲液 D。

(7) MD 0.6：含 0.6 mol/L KCl 及 10% 甘油的缓冲液 D。

(8) 250 mmol/L KCl 洗液（WB 250)：20 mmol/L HEPES ( pH 7.9 )，0.01% NP40，0.5 mmol/L DTT，250 mmol/L KCl。

(9) 0.1 mol/L ATP ( pH 7.0)。

(10) 0.5 mol/L 磷酸肌酸（pH 7.0 )。

(11) 链亲和素琼脂糖凝胶封闭缓冲液：在 WB250 及链亲和素琼脂糖凝胶中加入 100 mg/ml 糖原、1 mg/ml 的牛血清白蛋白及 100 mg/ml tRNA（终浓度）。

(12) 5％ NP-40，用水配制。

二、操作方法

1. snRNP 的纯化

(1) 预吸附胞核提取物的制备

链亲和素琼脂糖凝胶有很强的非特异结合蛋白质的特性，为了避免非特异吸附蛋白质，有必要对它进行预处理。一般取至少 5 ml 细胞核提取物在 15 ml 的 Falcon 管中进行预处理。除非另有说明，所有过程都需在 4℃ 进行。链亲和素琼脂糖凝胶应在 1300 g 离心，过高的转速会破坏琼脂糖凝胶珠。

① 预洗涤：链亲和素琼脂糖凝胶与等体积的 WB250 混合，离心并弃去洗液。

② 加入等体积新鲜配制的 WB250，均分为 5 份，每一份琼脂糖凝胶应不少于所用细胞核提取物的 0.6 倍体积。即，如果用 5 ml 细胞核提取物，链亲和素琼脂糖凝胶每一份至少为 3 ml。离心并弃去所有洗液。

③ 用 WB100 1：1 稀释细胞核提取物，加入到一份琼脂糖凝胶中。

④ 放在转轮上慢慢转动 1 h。

⑤ 1300 g 离心 2 min。

⑥ 取上清加入到一份新的链亲和素琼脂糖凝胶中。

⑦ 重复步骤 ④~⑥ 三次。

⑧ 离心两次以保证完全去除链亲和素琼脂糖凝胶。

⑨ 如果不进行下一步操作，将预吸附的细胞核提取物分成小份，如 1 ml 每份，在液氮中速冻后储存于 -80℃。

(2) 一步反义亲和选择法纯化 snRNP ( AAS )

① 将所需量的预吸附细胞核提取物在 30℃ 迅速融化，下面按 1 ml 预吸附细胞核提取物进行操作。

② 在 1.5 ml 微量离心管中混合下列试剂：生物素化反义 2'-O-甲基 RNA 寡核苷酸 1~5 nmnol，15 μl 0.1 mol/L ATP，10 μl 0.5 mol/L 磷酸肌酸，2 μl 1 moI/L MgCl2，加水至 70 μl。

③ 将 70 μl 预混液加至 0.9 ml 预吸附的细胞核提取物中，轻轻混合。

④ 加 30 μl 5 mol/L NaCl，使混合液中 NaCl 终浓度为 250 mmol/L。

⑤ 于 30℃ 温育 1 h。

⑥ 13000 g 离心 30 s，去除非特异的沉淀。

⑦ 把上清转移至加有 0.15 ml 链亲和素琼脂糖凝胶的新管中，链亲和素琼脂糖凝胶应先用 WB250 预洗两遍。

⑧ 于 4℃，在转轮上混合 90 min。

⑨ 1300 g 离心。

⑩ 弃去上清，用 0.9 ml WB250 重悬链亲和素琼脂糖凝胶，混合 5 min。

⑾ 重复步骤 ⑨ 和 ⑩ 三次。取出 1/10 体积的琼脂糖凝胶浆（约 0.115 ml ) 保存，用以分析共选择（co-selected） 的 RNA。这是确定选择的效率和特异性所必需的。

⑿ 离心剩余物，弃上清。

⒀ 用 0.8 ml 8 mol/L 尿素重悬，室温旋转混合 30 min。

⒁ 9000 g 离心将上清液转移至一新管中。

⒂ 重复步骤 ⒁ 以确保完全去除链亲和素琼脂糖凝胶。

⒃ 在 1 ml 透析袋中用 3 L 蒸馏水透析，去除尿素。

⒄ 用旋转真空浓缩仪浓缩样品。

⒅ 用 Laemmli 上样缓冲液重悬蛋白，进行 SDS-PAGE 分析，银染法检测蛋白。

(3) 链亲和素琼脂糖凝胶的再生

① 用至少 5 倍体积的 8 mol/L 尿素重悬用过的链亲和素琼脂糖凝胶。

② 旋转混合 30 min。

③ 离心并去掉上淸液。

④ 加入几倍体积的 WB100。

⑤ 旋转混合 10 min，离心并去上清液。

⑥ 重复步骤 ④~⑤ 三次以上。

⑦ 用含 0.01% NaN4 的 WB100 重悬链亲和素琼脂糖凝胶，于 4℃ 保存。

⑧ 使用前补加 1/10 体积的新鲜链亲和素琼脂糖凝胶。

2. snRNP 的去除

(1) 高盐细胞核提取物的制备

除非另有说明，下列所有操作都应在 4℃ 进行。

① 收集对数期早期至中期的 HeLa 细胞。也可以购买冻存的细胞，冻存的细胞用前必须在 30℃ 速融。

② 用 5 倍细胞体积的缓冲液 A 洗细胞，4℃，750 g 离心 10 min 收集细胞。再重复洗涤一次。

③ 用 2 倍体积缓冲液 A 重悬细胞，转移至 40 ml Dounce 匀浆器中，用 A 型研杵研磨 10 次破碎细胞。可在倒置显微镜上观察细胞裂解情况，多次研磨可以释放出全部钿胞核，一般需 20~30 次。

④ 把裂解的细胞悬液转移至 50 ml 橡树岭离心管中。4℃，750 g 离心 5 min，沉淀胞核。

⑤ 弃去上清，小心操作以免破坏胞核。25100 g 再离心 20 min。

⑥ 弃去上清，用缓冲液 S 重悬沉淀。每 109 个细胞用 4.5 ml 缓冲液 S。

⑦ 把重悬的胞核转移到 40 ml Dounce 匀浆器中。用 B 型研杵研磨 10 次，可在倒置显微镜下观察胞核裂解情况。再一直研磨至看不到完整的胞核为止，一般需 20~30 次。把裂解物转到 15 ml Falcon 管中，4℃ 慢慢旋转混合 30 min。

⑧ 在 50 ml 橡树岭管中，4℃，25100 g 离心 30 min。把上清转移到 25 mm 宽的透析袋中。

⑨ 用 3 L （每次 1L）MD 0.1 缓冲液透析 3.5 h。此时会有相当量的沉淀析出。

⑩ 用 15 ml Falcon 管在台式离心机上以 600 g 离心 10 min，弃去沉淀。

⑾ 用 3 L（每次 1L）MD 0.6 缓冲液透析 1.5 h，即获得高盐细胞核提取物（HSNE）。

⑿ 将高盐细胞核提取物（high salt nuclear extract，HSNE) 分成 1 ml 每份，在液氮中速冻后，储存于 -80℃ 。

2. 反义亲合去除 snRNP ( AAD )

① 如果用冻存的高盐细胞核提取物，先在 30℃ 水浴中融化。

② 把下列成分加入到高盐细胞核提取物中：适量的生物素化反义寡核苷酸、1.5 mmol/L ATP、5 mmol/L 磷酸肌酸及 0.05% NP40， 如果用常规的透析袋，至少需 1.5 ml 高盐细胞核提取物，否则连续的稀释会导致蛋白活性的丧失。若只有少量的高盐细胞核提取物，可选用 1 ml 的微量透析袋。一般用 2~5 ml 的高盐细胞核提取物。

为了避免被稀释，上面所加入物质的体积加起来不应超过提取物总体积的 10%。即，每 ml 高盐细胞核提取物中加入 16 μl 0.1 mol/L ATP、11 μl 0.5 mol/L 磷酸肌酸、10 μl 5% NP40 和 40~50 μl 反义寡核苷酸。反义寡核苷酸的用量取决于要去除的 snRNP 的含量。

③ 于 30℃ 温育 30 min（如果去除 U1 和 U2 snRNP）或 1 h（如果去除 U4/U6 和 U5 snRNP）。

④ 在温育之前需准备好链亲和素琼脂糖凝胶。链亲和素琼脂糖凝胶需预先封闭在封闭缓冲液中以封闭非特异结合位点，封闭液的体积约为链亲和紊琼脂糖凝胶体积的 30%。2 ml 的提取物进行每个循环的去除反应需 0.5 ml 的链亲和素琼脂糖凝胶。

⑤ 在台式离心机上 1300 g 离心 1 min 去掉预封闭缓冲液，用 3 倍体积的新 WB250 混合洗涤，重复洗涤 2 次以上。把链亲和素琼脂糖凝胶按每次用的量分成几份。

⑥ 1300 g 离心 1 min，离心两次以完全去掉 WB250，这对避免提取物稀释是很重要的。

⑦ 把温育后的胞核提取物加入到链亲和素琼脂糖凝胶中。如果是 2 ml 提取物，则可以把提取物分成两等份进行操作，即在 2 ml Eppendorf 管中，0.5 ml 链亲和素琼脂糖凝胶中加入 1 ml 提取物。提取物可在最后透析前再合并。

⑧ 胞核提取物与链亲和素琼脂糖凝胶在 0℃ 旋转孵育 45 min，这一步很重要，可把用封口膜密封的 Eppendorf 管放在 50 ml Falcon 管中，装满碎冰后在 4℃ 温室中转动。需要注意的是，0.6 mol/L KCl 和链亲和素琼脂糖凝胶混合后对胞核提取物有不良影响，所以这一步操作要快。

⑨ 1300 g 离心 1 min 去掉链亲和素琼脂糖凝胶，再用新的链亲和素琼脂糖凝胶重复步骤 ⑧ 和 ⑨。

⑩ 1300 g 离心两次（每次 1 min）以去掉链亲和素琼脂糖凝胶，合并提取物。

⑾ 用 10 mm 宽透析袋在缓冲液 D（1 L 一换，共 3 L）中透析 1.5~2 h。

⑿ 把除 snRNP 后的提取物分成小份（如 50 μl 每份），液氮中速冻后在 -80°C 保存。