串色问题
当多标样品用两种以上的激光扫描时，串色问题在好几个通道都会观察到，图 5（ c）和图 5(f)显示了鼠脑的一个厚切片，用 Alexa Fluor488 标记神经丝、用 Alexa Fluor 568 标记神经胶质纤维酸性蛋白(GFAP)，用 DRAQ5 染核。当样品同时用 3 个激光扫描时（图 5c），串色会在第二和第三个通道发生，在样品的中间丝里就意味着有可能的共定位。然而，若开始用序列扫描并收集数据时，神经丝只出现在它们各自的通道里（图 5f），消除了这些结构中荧光团共定位的可能。荧光共振能量转移(FRET)，理论上可以测量位置离得很近的两个荧光团的距离，也是监测共定位的一个潜在有用的工具。然而，在共定位分析中这个现象经常会导致一些假象，除非在实验的设计过程中，对 FRET 的一些参数做了很好地理解并认真进行了考虑。尤其是在第一个荧光团的发射光谱和第二个荧光团的激发光谱重叠的地方，研究者应该特别关注。这些样品中的能量转移表现为：第一个荧光团的荧光发射意外地降低同时伴随着第二个荧光团的荧光发射意外地增加。紧密相关的荧光团之间的相互作用可导致发射荧光信号的淬灭，这与环境条件有关。
共定位分析中许多潜在的问题都可通过仔细关注样品制备技术来规避。正如上面讨论的，荧光探针应该选择发射光谱分离比较大的且具有最小叠加的组合。如果可能的话，选择绿颜色的具有窄发射的荧光团（比如 Alexa Fluor 系列或量子点）及红颜色的在深红区或近红外区有发射的荧光团。原发性和继发性抗体必须检测交叉活性及非特异性背景染色。合成荧光团及标记的继发性抗体的浓度应该优化以确保相似的亮度，尤其是当对象丰度根本不同时。影响荧光团亮度的因素包括激发效率、量子产率、消光系数、浓度及环境因素，如 pH值、离子浓度、疏水性及粘性。对每一个荧光团都应单独制备 control 样品，在不染色的情况下，分别分析串色和自荧光。仔细注意着色过程中的微小细节，就会降低使用图像处理软件恢复数字图像的必要性。
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