气质联用法测定市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量
1 概述
氨基甲酸乙酯（Ethyl carbamate，EC）是一种具有基因致癌的多位点致癌物质，在2007年2月被国际癌研究机构将其从2B类（“可能令人类患癌的物质”）升级为2A类（“能令人类患癌的物质”）致癌物质[1]，[2]，但是在它被定义为可能致癌物质以前，它曾经在医学上作为抗肿瘤药物和麻醉剂使用过[3]。它是发酵食品（如酱油、腐乳、奶酪）和酒精饮品在发酵过程中的中间产物[4]。
酱油是我国各大菜系中一种传统的调味品，它是用豆、麦或者麸皮酿造的液体调味品，因为这种酿造技术属于发酵工程，在发酵过程中容易发生各种复杂的化学反应，生成如氨基甲酸乙酯、氯丙醇、酚醛类等物质。其中氨基甲酸乙酯这一物质作为一种2A类致癌物质，它具有生物遗传毒性，在进入人体后会对免疫系统造成不可逆的损伤，它在人体内被细胞色素P450氧化后，氧化产物能够诱导Cμ2+调控的DNA发生损伤，从而导致癌变[5]。所以越来越多的国家认识到这种物质的危害性，国际上现行的氨基甲酸乙酯的检测方法是气质联用检测法[6]，我国目前对酱油中氨基甲酸乙酯的含量限定及检测方法尚无标准，本研究以固相萃取结合GC/MS建立一种使用外标法来测定市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量的方法，为贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯的含量限定作一定参考。
2 试验材料、试剂及仪器
正己烷使用液：（色谱纯）天津市化学试剂厂
二氯甲烷使用液：（分析纯）成都金山化学试剂有限公司
甲醇使用液；（分析纯）纯度≥99.5%，天津市富宇精细化工有限公司。
丙酮使用液；（分析纯）天津市康科德科技有限公司
氨基甲酸乙酯标准品；
1号酱油；味莼园牌黄豆酱油，贵阳味莼园食品有限公司
2号酱油；味莼园牌特鲜酱油，贵阳味莼园食品有限公司
3号酱油；味莼园牌卫生酱油，贵阳味莼园食品有限公司
4号酱油；味莼园牌鲜酱油，贵阳味莼园食品有限公司
5号酱油；黄豆酱油，贵阳市白云区酱菜厂
气相色谱-质谱联用仪；安捷伦公司7890A/5975C型GC/MS
实验室专用超纯水机；四川沃特尔科技发展有限公司
固相萃取仪；12位方缸固相萃取装置，月旭材料科技（上海）有限公司
3 实验条件
3.1 仪器条件
进样口温度230℃，初始柱温100℃保持3min，阶升20℃至180℃，后运行230℃保持2min，分流模式，分流比1：10，溶剂延迟2min，全扫描模式。
3.2 固相萃取条件
酱油中成分复杂，基质种类繁多，极容易对检测结果造成干扰，所以在进行仪器分析方法检测含量之前对酱油进行预处理，尽可能的进行分离纯化，将其中所含的EC提取出来[7]。由于氨基甲酸乙酯属于极性易溶于水的物质[7]，为保证酱油中样品检测的回收率，经过实验证明EC需停留在萃取柱中的萃取时间在30min，选择添加丙酮-二氯甲烷（V/V）洗涤液来进行洗脱，而且体积比为1：9的丙酮-二氯甲烷洗脱液过C18萃取小柱时，回收效果最好。
3.3 氨基甲酸乙酯气质联用的定性离子的确定
建立一个氨基甲酸乙酯检测方法，进样口温度230℃，选择分流模式，分流比1：10；柱温：初始100℃，保持3min，后20℃/min上升至180℃，后运行230℃，保持2min，辅助加热器230℃；MS条件：溶剂延迟2min，全扫描模式，全扫描参数开始 30结束450。
以浓度为10μg/mL的EC标准溶夜进样一次，检测得到一个峰型较好的峰图，对质谱图进行Nist谱库检索，谱库检索为氨基甲酸乙酯这一物质，并确定保留时间为5.75min，确定氨基甲酸乙酯的定性离子为44、62、89，总离子流图如图1。
4 试验过程
4.1 标准曲线的绘制
4.1.1 EC标准溶液的配置
用分析天平精密称定100mg在120℃干燥至恒重的EC标准样品，用甲醇定容至100ml得到浓度为1mg/mL的母液（冰箱里3℃存放）；准确吸取1000μL母液于100mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，所得溶液即浓度为10μg/mL的标准溶液。
4.1.2 梯度浓度的EC标液的配置
准确量取100μL、1000μL、2000μL、5000μL、10000μL浓度为10μg/mL的EC标准溶液置于10mL的容量瓶中用甲醇定容至刻度，即为0.1μg/mL、1.0μg/mL、2.0μg/mL、5.0μg/mL、10.0μg/mL的EC标准溶液。
4.1.3 标准曲线的制作：按照3.3的方法分别进样5个不同浓度的EC标液，然后以浓度为横坐标、峰面积为纵坐标建立标准曲线。
4.2 样品处理
称取1号市售酱油5mL于干燥洁净的烧杯中，对固相萃取柱作如下处理，将固相萃取柱装上样，依次用2mL甲醇和正己烷活化萃取小柱，接着再用4mL纯化水平衡萃取小柱。将烧杯中的酱油倒入萃取小柱中抽真空，让酱油停留在萃取小柱中保持30min，然后将萃取小柱上的酱油缓慢抽到废液管中，再用正己烷淋洗以洗去杂质，最后用1：9丙酮-二氯甲烷洗脱液以自然流速洗脱，洗脱液置于45℃恒温水浴锅中浓缩至0.3mL左右，转移至进样瓶中并用甲醇加至1mL，对2到5号酱油同操作。 4.3 酱油中氨基甲酸乙酯含量的测定
将4.4中的1至6号酱油处理液用标签纸做好相应标记，按顺序放入GC/MS自动进样器的旋转盘上。调用方法，并且改变MS扫描模式为离子扫描模式，离子扫描参数44、62、89。分别进样1至5号进样瓶，检测五个样品中的氨基甲酸乙酯含量，每个样品瓶分别进样6次。
4.4 加标回收率试验
取2号酱油样品（含量约0.43μg/mL）1mL，分别添加0.5μg/mL和0.75μg/mL和1.0μg/mL的EC标准溶液各1mL，每个浓度的标准溶液都添加三份，共九份，按照3.3项下的检测方法进行检测，检测出加标后的测定值。
加标回收率公式：加标回收率=（加标试样测定值-试样测定值）/加标量×100%。
4.5 精密度实验
取5号酱油处理液，连续六次测定数据，计算相对标准偏差。
4.6 线性范围
取浓度为10μg/mL的EC标准溶夜，GC/MS进样1μL，选择离子扫描模式检测，以62离子作为定量离子峰，以氨基甲酸乙酯浓度为横坐标，62离子强度为纵坐标做标准曲线[8]，在安捷伦工作站里建立曲线校正方法，得出它的线性条件和线性范围。
4.7 检测限的测定
取浓度为2μg/mL的氨基甲酸乙酯标准液，GC/MS进样1μL，对其进行性能报告分析，然后根据信噪比公式D=3S/N，由此推算出学院GC/MS仪器用这种方法检测氨基甲酸乙酯的检测限。
5 结果分析
由实验结果可知氨基甲酸乙酯标准溶液在1-10μg/mL浓度范围之间线性关系良好，实验所得线性方程为Y=2.906X-7.925（r2=0.9938）。
由性能报告峰谱图89，所以其检测限应该为0.014μg/mL，按照信噪比S/N为10得出定量限为0.048μg/mL。
回收率实验的结果分析
平均回收率为97.78%，RSD为2.59%，表明该方法准确度较高，可以准确地检测出酱油中的氨基甲酸乙酯的含量。
精密度实验结果分析
5号酱油的相对标准偏差RSD（n=6）为6.5%，表明该仪器精密度良好。
市售酱油中的氨基甲酸乙酯含量确定
贵州地区5种市售酱油结果见表1，表明1至4号酱油中氨基甲酸乙酯浓度较5号酱油中的多。
6 结束语
经过固相萃取和液液萃取的结果分析，该方法用到固相萃取对酱油进行净化和提纯是因为EC这一物质在C18萃取柱中溶解度比在液体中的溶解度高，固相萃取法能有效分离提取酱油中EC。经过GC/MS仪器检测后，利用系统自带的质谱可以轻易的发现EC这一物质，虽然学院的气质联用仪在这个实验中检验的质谱和标准谱库中的EC质朴图并不完全一样，但是这是由于EC的物质结构和我们所用的质谱检测器的检测原理不同而造成的[9]，这并不影响实验结果。
GC/MS检测法的相对标准偏差为6.5%（n=6），这种方法的检测限为0.014μg/mL，线性范围为1-100μg/mL，加标回收率可达到97.78%，加标回收率的RSD可达2.59%，这种方法具有灵敏度高、紧密度良好、线性范围较广等特点，贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯含量在0.34-0.44μg/mL（既是340-440μg/Ml）之间，超过20μg/L。结果表明采用SFE结合GC/MS法对贵州地区市售酱油中氨基甲酸乙酯的检测进行定性、定量分析能达到检测目的。
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