微核实验在染色体水平检测DNA损伤实验（二）
| 注意事项 | （1）在我们进行 CBMN 实验过程中，最容易产生问题的是在玻片的制备和染色环节 ，因为计数结果的好坏依赖于制片的质量。主要注意事项：（a） 在将细胞置于玻片前应轻轻吹打，避免细胞结块； （2）要做重复以确保结果可信，同时也可计算组内重复标准差数据。细胞遗传毒性实验需要满足严格的数据分析标准，如 果 C V 值大 于 1 0 % 就应剔出。由于是肉眼计数观察实验，较大的标准差是可以接受的。根据我们的经验和国际实验室间计数比较的结果，基线数据 C V s 大于 4 0 % ，则不能接受；对于暴露于放射条件下培养，每 1000 个 BN 细胞中有大于 100 个 M N 时， C V s 应小于 2 0 % 。 （3）不熟练操作者（如学生和新技术员）的计数不可靠，除非他们在计数标准对照玻片时 C V 值达到可被接受的程度（不大于 40% ) 。 （4）不同计数人员间的差异是造成 M N 实验差异的主要原因之一 （71)。此，在一项研究中使用同一个技术员是很有必要的，最好有两名技术员，用如 图 2 所示的同样方法对重复组进行计数。另一方法是用有「低」、「中」、「高」 M N 频率的标准片对计数员进行校正。每一个计数员对标准玻片的计数可被用来计算一个校正值。这种方法虽然仍在完善中，但由于它考虑了在同一个实验室或实验室之 间计数员的视觉差异，从而也是值得重视的。 （5） 另一造成计数员和实验室间差异的重要影响因素是显微镜的质量和镜头。根据我们的经验，统计核质桥受到显微镜的影响，因为细小的核质桥会被质量较差的镜头忽 略。需要注意的是计数员应避免在实验中变换显微镜，并且实验室负责人应统一显微镜的镜头，并将其升级至一个较高的水平。我们推荐使用可以提供优质清晰度、 图像对比度和平整度的系统。系统应有放大 1000 倍的能力。 （6）常见问题之一是确定在 CBMN 实验中 BN 细胞的数量。虽然记数从 500 到 2000个 BN 细胞都有过报道，被认可的做法是每次处理或时间点计数不少于 1000 个BN 细胞。另一种方法是计算 B N 细胞数直到出现固定数量的微核（例 如 4 5 个微核)。后者的优点是当 MNi 数量较少时需要较多的 BN 细胞，这样能在不同处理之间保持统计效力。缺点是当 M N 频率较低时可能需要计数超过 2000 个细胞。我们的实验显示每个重复统计 1000 个 BN 细胞可以得到可信结果。 （7）在观察玻片时首先计数单核细胞、双核、多核、凋亡和坏死细胞频率来确定 ND1 和NDCI。 然后计算双核细胞中的微核、核质桥和核芽数量以确定遗传损伤的比例。 |
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