1. 玻璃珠的活性
玻璃珠(10 g)在 40 ml 5% 硝酸中 80~90℃ 加热 1 h。其后珠子用蒸馏水洗三次,并被转移到 PE 容器中避免硅烷化和酶固定到长颈瓶的壁上。添加水(10 ml)和 3 g 3-氨基丙基-三乙氧基硅烷,pH 先用浓 HCl 调节,最终用 2 mol/L 的 HCl 将 pH 调到 3~4,用 pH 指示纸来检测(pH 电极会被损坏)。反应的混合物在 65℃ 中孵化 12 h,之后珠子在吸滤器(瓷器,无玻璃粉)上用水冲洗 5 次,用丙酮冲洗 3 次(每次 20 ml)。最后珠子在 55℃ 干燥 20 min。
2. 重氮化作用
后面的程序必须用玻璃容器。为了玻璃珠子的活化,添加 25 ml 二氯甲醇、1.5 g 三乙胺和 5 g 对硝基苯酰氯化物,回流煮沸 4 h,要避免潮湿。珠子用 10 ml 二氯甲醇冲洗 3 次,在 55℃ 短暂干燥。之后为了自由氨基的重氮化作用,这些珠子被转移到含 1 g NaNO2 的 100 ml 2 mol/L HCl 溶液中,在室温静置 20 min。用水剧烈地冲洗珠子后,将珠子在 40 ml 含 2 g 连二亚硫酸钠的 40 ml 水溶液中回流 lh。芳基胺珠子形成,用 20 ml 的水冲洗三次,转移到圆底的长颈瓶中,添加 88 ml 的 2 mol/L HCl。长颈瓶被安装在旋转的脱水器上,在冰浴中旋转,保证在 0℃ 冰浴。在 20 min 内,将 1.12 g 的 NaNO2 慢慢地添加一部分,在其间长颈瓶在非真空状态下一直转动,在添加了最后一部分之后,长颈瓶必须用一个弱的喷水式真空推进器旋转 10 min(大约 20 mbar),用于排出含氮气体。产生的重氮基玻璃用 20 ml 的冰水冲洗 3 次,之后必须马上用于固定。在用于固定之前的这段时间必须保存于 4℃。
3. 酶的固定
酶溶液(10 mg 溶于 10 ml 的 0.1 mol/L pH 7.5 磷酸钾)被添加到玻璃珠子中,长颈瓶在 4℃缓慢旋转过夜(12~16 h)。其后玻璃珠子用 5 ml 0.1 mol/L pH 7.5 的磷酸钾缓冲液冲洗 3 次。浮在表面的缓冲溶液被收集,用来决定未被固定的蛋白质和酶的活性,用这种方法来评估固定的效率 展开 |