裸鼠前列腺原位肿瘤模型的建立实验

雄性BALB c裸鼠Du145 细胞系

胎牛血清RPM I 1640培养液戊巴比妥钠胰酶EDTA

CO2孵箱棉签手术刀纱布针筒针头甲醛光学显微镜

一、实验准备
雄性BALB / c裸鼠10只，6 wk龄，体质量20 g左右，均在SPF条件下层流架内饲料饮水自由摄入。 Du145细胞系用含100 mL /L胎牛血清(杭州四季青公司)的RPM I 1640培养液(美国Gibco公司)在37℃，50 mL /L CO₂ 的孵箱内培养，以1. 25 g/L胰酶和0. 2 g/L EDTA的混合液消化传代。
 

二、具体操作　

1.  裸鼠用10 g/L戊巴比妥钠( 75 mg/kg)麻醉，仰卧位，胶带固定四肢，下腹部正中横切口1 cm，暴露膀胱和精囊腺，用棉签轻压膀胱顶壁、腹侧壁，并向下游离至膀胱颈,推开肌肉及生殖腺进一步暴露前列腺，可见其大小约1. 0 mm ×1. 5 mm ×2. 0 mm，分左右2叶，呈粉红色，有明显的腺体组织特征。

2.  用1 mL TB 针筒、29G针头轻轻挑起一侧前列腺包膜，缓慢进针，直至顶起对侧包膜，明确针尖进入包膜后，再缓慢推注Du145细胞悬液50 μL (6 ×10⁶ 个) ，以包膜向上鼓起,脱离腺体表面为满意标准。

3.  恢复脏器的解剖位置，用720可吸收线分别间断缝合腹壁肌肉层和皮肤层,待鼠苏醒后回笼。

4.  以裸鼠出现恶液质、处于濒死状态作为观察终点，颈椎脱臼法处死。

5.  尸解并观察荷瘤部位肿瘤的生长情况。

6.  裸鼠处死后，立即在100 mA，40 kV，5. 23 ms条件下行X线检查。
 

7.  裸鼠与球管距离为1. 0 m，然后取前列腺、膀胱、盆腔淋巴结、肝脏和肺脏标本， 40 g/L 甲醛固定、石蜡薄层切片4 μm， HE染色后光镜下观察有无转移灶。

一、实验讨论

人前列腺癌动物模型是研究前列腺癌发病机制、肿瘤与宿主关系、癌肿侵袭与转移过程和治疗措施有效性不可缺少的理想实验工具，因此，建立理想的前列腺癌动物模型应能最大程度地模拟人类前列腺癌的发生过程并具备以下特点： ①人源性肿瘤，可分泌前列腺特异性抗原( PSA) ； ②肿瘤特性与人类前列腺癌相似；③对激素的治疗反应与人前列腺癌相似。

裸鼠因其免疫缺陷特性成为建立人类肿瘤动物模型的最佳载体。以往制作前列腺癌裸鼠模型时多选择皮下作为荷瘤部位，接种方便、易于观察，但是根据Paget的“种子与土壤”( Seed and Soil)学说，肿瘤的生长和转移依赖于一个合适的微环境，因此原位种植较皮下接种具有更高的致瘤率和转移机率，且皮下移植瘤模型并不能很好地模拟前列腺癌在人体内的自然生长过程以及许多生物学行为，而原位种植不仅使肿瘤细胞获得了更接近人体内的生长微环境，而且其中丰富的内源性生长因子，能够提高移植成功率，并形成与临床相似的转移模式。

Sato等对比前列腺癌LNCaP细胞悬液分别作SCID鼠皮下和原位种植后的情况，结果皮下组中100%成瘤，无一发生淋巴结及远处转移；原位组中89%成瘤，但全部发生腹膜后和纵隔淋巴结转移， 40%发现有镜下肺转移。

Rembrink等和Wang等用前列腺癌PC23，PC23212521L，TSU2Pr1和LNCaP细胞作裸鼠的原位种植模型,致瘤率高，淋巴结、肺部转移率极高。由于裸鼠前列腺非常小(约50 mg)，因此进行肿瘤细胞注射需要特别精细的操作。 而且，注入肿瘤细胞后10 ～180 min，即使没有直接刺入血管，也容易产生自发的淋巴道和血道转移而造成人为的播散。

进行了多次预试验，最终达到了包膜向上鼓起，脱离腺体表面的要求，最终成瘤率为60%，与国内王鹏飞等的结果相似。观察到，所有小鼠术后均发生急性重症肝炎，其性质可能是一种自身免疫性急性重症肝炎(A IH)。

目前A IH的发病机制尚不清楚,但有研究表明药物、环境和病毒感染可能是A IH的促发因素.。由于小鼠过早出现肝衰竭。因此本组模型中未能观察到肺转移、淋巴结转移和骨转移。另外，种植组织学完整的瘤块比肿瘤细胞悬液的成瘤率和转移率更高，但对显微器械和操作精细程度的要求更高。因此，原位注射肿瘤细胞逐渐成为当前的主流技术。

此外，成熟的建模技术有助于“培育”出生物学特性更接近临床实际的新细胞株。 例如，绝大多数前列腺癌细胞株不能分泌PSA，不利于肿瘤模型的监测， LNCaP虽能分泌PSA，却属于一种雄激素依赖型细胞株，限制了它在雄激素非依赖型前列腺癌中的研究应用。

Thalmann 等利用LNCaP建立不同的免疫缺陷动物模型，培育了一系列亚细胞系,既保留了PSA的分泌特性，又对雄激素非依赖,恶性度更高。利用这些亚细胞系在裸鼠身上分别皮下和前列腺原位接种,均建立了较LNCaP细胞更具致瘤能力和骨转移潜能的动物模型。

Harper等利用TEN12在不同条件下造模后,也成功地培育了两种新的细胞亚系TEN12F和TEN12C，为在分子水平解释人前列腺癌从雄激素依赖型向非依赖型转变的机制创造了条件。