实验概要

本实验运用双向电泳技术、计算机图像分析与大规模数据处理技术以及质谱技术研究了。钙调素调节的下游效应蛋白的表达模式和活性，通过鉴定这些蛋白、分析它们的表达模式以及它们依赖于Ca² 的与CaM的相互作用，将有助于我们了解钙-钙调素信号在时间和空间上的特异性，初步探讨了细胞如何通过钙-钙调素信号响应不同生物/非生物刺激而引发下游一系列不同的复杂细胞学事件，从而进一步加深我们对于细胞极性生长调节机理的了解。

主要设备

IPGphor II等电聚焦系统(Amersham Biosciences，Sweden)

ZipTip C18柱(Millipore，MA，USA)

电喷雾离子化四级杆飞行时间串联质谱(ESI-Q TOF-MS/MS，Micromass，UK)

实验材料

白杄花粉

实验步骤

1. 材料培养

白杄花粉悬浮于以下三种培养基，25℃条件下振荡(120 rpm)暗培养。

1) 12%蔗糖 0.01% H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ (CKM)

2) 12%蔗糖 0.01% H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 25 µM TFP

3) 12%蔗糖 0.01% H₃BO₃ 0.03% Ca(NO₃)₂ 50 µM TFP

2. 花粉总蛋白的提取

收集培养20  h的白杄花粉，液氮研磨，将粉末悬浮于12.5%三氯乙酸溶液中(丙酮配制，含0.07%巯基乙醇)，于-20℃放置两小时。15000 rpm  4℃离心10 min，弃除上清液，重悬于三倍体积的冷丙酮中(含0.07%巯基乙醇)，-20℃过夜。15000 rpm  4℃离心，弃除上清液，沉淀重悬于80%丙酮中(含0.07%巯基乙醇)，-20℃放置1 h。离心弃除上清液，待丙酮挥发完后，用裂解液溶解(7 M  urea，2 M thiorea， 4% (w/v)CHAPS，2%(V/V) ampholine pH 3.5-10，1% DTT，50  µg/mL PMSF)，之后离心取上清，通过上述过程提取出来的蛋白质，用Bradford法测定浓度(DU 640  Spectrophotometer，Beckman，USA)。

3. 双向电泳和图像分析

双向电泳实验主要依据《安玛西亚双向电泳手册》中推荐的方法略加改进。等电聚焦之前将干胶条 (pH 3-10 L，24 cm)于450  µl再水化液(包含样品)中水化上样(含8 M urea，2% (w/v) CHAPS，0.5% (v/v) ampholine pH  3-10，0.002% bromophenol blue)，室温过夜。再水化溶液中含600 µg蛋白质样品。等电聚焦实验使用IPGphor  II等电聚焦系统。等电聚焦使用下列参数：500 V 1 h，1000 V 1 h，然后将电压增加到8000 V，升压模式选取“step by  step”，最后总电压伏时数为64 kVh。第二向电泳之前胶条先平衡两次，每次分别15 min，第一次平衡液为：50 mM Tris-HCl  (pH 8.8)，6 M urea，30% glycerol，2% SDS，0.002% bromophenol blue， 1%  DTT；第二次平衡液：50 mM Tris-HCl (pH 8.8)，6 M urea，30% glycerol，2% SDS，0.002%  bromophenol blue，2.5%  idoacetamide。平衡后胶条放置在12.5%单一梯度聚丙烯酰胺凝胶上，用0.5%的琼脂糖固定，每块胶30  mA，电极缓冲液保持在12℃进行第二向电泳，直到指示剂到达胶底部。凝胶用0.1%考马斯亮兰R-250染色。

电泳后的凝胶扫描保存图像(300 dpi)，ImageMaster 2D Platinum 5.0软件分析(Amersham  Biosciences，  Sweden)，表观分子量根据标准蛋白分子量来确定。同一处理的二维电泳至少重复3次，切取差异表达蛋白进行胶内酶解和质谱分析。

4. 胶内酶解

将蛋白质斑点从胶上切下后，用50%乙腈和25 mM NH₄HCO₃脱色，50 mM NH₄HCO₃处理在40℃下处理1  h，水洗一次，10 mM DTT，60℃还原1 h，还原后真空冷冻抽干，再用40 mM碘乙酰胺处理30 min后水洗抽干，最后用10 µl  20 ng/µl trypsin (Proteomics grade，Sigma) 37℃下暗处酶切12-16  h。肽段用0.1%三氟乙酸和50%乙腈提取，真空冷冻浓缩至10 µl左右，-80℃保存待用。

5. 质谱鉴定及数据库检索

胶内酶解后的样品用ZipTip C18柱脱盐，终体积约为2 µl。电喷雾离子化四级杆飞行时间串联质谱测定序列。串联质谱数据经MassLynx^TM软件处理后生成peak list文件，以此文件利用MASCOT搜索引擎(www.matrixscience.com)进行数据库检索，选择NCBI non-redundant数据库(Bermann et al.， 2000; Wheeler et al.，  2004)；对于检索结果网站提供一个可信度分值(MOWSE Score)，如果实际值大或等于该值则错误率小于5%。当出现多个大于标准MOWSE  Score值的时候，一般选取得分最大的结果，同时还参考其匹配的肽段序列覆盖率(sequence  coverage)以及双向电泳胶上表观分子量和等电点确定。全部的检索结果经EST other数据库检索验证。