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淋巴细胞增殖功能的测定实验

2019.11.12

           

实验方法原理 T细胞、B细胞表面具有识别抗原的受体和有丝分裂原受体,在特异性抗原刺激下可使相应淋巴细胞克隆发生增殖。植物血凝素(PHA)、刀豆蛋白A(ConA),抗CD2、抗CD3 McAb作为多克隆刺激剂可选择性地刺激T细胞增殖;而抗IgM、含葡萄球菌A蛋白的菌体(SAC)、脂多糖(LPS,对小鼠有作用)则刺激B细胞发生增殖;美洲商陆(PWM)、肿瘤刺激剂PMA对T、B细胞的增殖均有刺激作用。最近发现,integrin家族中VLA组中某些受体与相应配体结合后也能活化T细胞。目前临床上最常选用PHA刺激PBMC,根据形态学或氚标记胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入率测定T细胞的增殖水平。
实验材料

PBMC

试剂、试剂盒

闪烁液 RPMI1640 CO2孵箱

仪器、耗材

细胞收集仪 β液闪仪

实验步骤

1.  无菌从肝素抗凝血中分离外周血单个核细胞(PBMC)洗涤后用10%FCS RPMI1640调整细胞数为1~2x106/ml

      
2.  加入96 孔培养板中,1~2x105 细胞/100 ul/孔,每组设3孔。加入最适剂量PHA,100 ul/孔,同时设不加PHA阴性对照。如观察细胞因子(如IL-2)或其它刺激物(PMA)对增殖功能的调节作用,则根据加入因子的浓度而确定加入量,一般每孔最终体积为200 ul,37 ℃、5 % CO2孵育,66 h

        
3.  每孔加入0.5~1 uci 3H-TdR(50ul),继续培养6~12 h

         
4.  用DYQ-Ⅱ型多头细胞收集仪收集样品于"9999"型玻璃纤维滤纸上

            
5.  烤干后β液闪仪计数

  
6.  计算
 

(1)增殖水平直接用CPM值表示。

(2)也可用刺激指数(SI)表示
 

  PHA(或实验组)cpm-机器本底

SI=───────────────

  阴性对照组cpm-机器本底

            展开           
注意事项

1.  注意无菌操作。

  
2.  PHA、ConA、PWM、LPS等在正式实验前均需摸索最适剂量或亚适剂量。厂家和批号不同丝裂原作用常有很大差别,如Wellcome公司PHA终浓度最适剂量为1~3 ug/ml,而广州医工所PHA约为20~100 ug/ml。

  
3.  根据实验需要,对不同种(人、小鼠、大鼠、兔、狗等)不同来源淋巴细胞(胸腺、脾脏、淋巴结、扁桃腺、外周血等)均应进行最适细胞浓度、圈养时间和刺激物浓度的摸索。

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其他

来源:医学基础免疫学实验指导,主编金伯泉李恩善,第1 版,北京:世界图书出版社,1990


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