钩端螺旋体、支原体和衣原体培养基
一、钩端螺旋体培养基—柯少夫(Korthof)培养基
[用途]
用于钩端螺旋体增殖。
[配法]
蛋白胨400mg，氯化钠700mg，碳酸氢钠10mg，氯化钾20mg，氯化钙20mg，磷酸二氢钾120mg，磷酸氢二钠440mg，蒸馏水500ml，无菌兔血清(灭活) 8~10ml。
将各成分溶于蒸馏水内煮沸20min，以滤纸滤，调至pH为7.2，分装烧瓶内，每瓶100ml，12l℃灭菌20min；无菌采取兔心血分离血清，置
56℃水浴箱中30min以破坏补体；上述蛋白胨盐溶液每100ml中加入无菌兔血清8~10m1；混合后，用无菌分装中号试管中，每管5m1；置56℃水浴箱30min；37℃温箱中孵育2天，剔去污染者。
注:
⑴ 为防止污染，每100m1培养基可加50mg磺胺嘧啶钠。
⑵ 为了促进钩端螺旋体生长，可于该培养基中加入维生素B12及烟酸(各1mg/100m1)，并将兔血清量自8 %减至5 %，培养基中不加氯化钙，（因氯化钙对生长无作用，且常形成沉淀物），再以100℃加热30min。用此法制得培养基清晰，无任何沉淀。
二、支原体培养基
1. 1.4 % PPLO琼脂培养基
[用途]
分离支原体。
[配法]
牛心(去脂绞碎)250g，氯化钠5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g，蛋白胨10g,酵母浸膏1g，琼脂粉14g，蒸馏水1L。
⑴ 牛心消化液配制：取去脂绞碎牛心250g，氯化钠5g及蒸馏水900m1混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g/L
氯化钠溶液中，然后与上述牛心消化液混合，放置50~60℃水温箱内消化2h，中间不断搅拌，消化后用两层纱布过滤，滤液煮沸5min，用滤纸过滤后，补足水分至原量，然后加酵母浸膏1g，混匀，冷却后调pH至8.0，分装后121℃灭菌15min备用。
⑵ 支原体基础琼脂：取上述牛心消化液(已加氯化钠)lL，加蛋白胨10g和琼脂粉14g，混合后，加热溶解，调pH至7.8~8.0，再加热煮沸，用脱脂棉或绒布过滤，过滤后分装于圆瓶中，每瓶70m1，121℃灭菌15min，备用。
⑶ 250g/L鲜酵母液制备:
食用鲜酵母块250g，加蒸馏水1L，混合后，煮沸2min，用滤纸过滤，滤后置4℃冰箱中过夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g/L氢氧化钠溶液调pH至8.0，再煮沸1次，冷却后，3000r／min离心45min，吸取上清液，分装于瓶中，121℃灭菌15min，放4℃冰箱中备用，可保存3月。
⑷
倾注平板：溶解基础琼脂，冷却至80℃左右，每瓶（70ml）内立即加预温在37℃培养箱内的无菌马血清或小牛血清20m1，250g/L鲜酵母浸出液10ml，10g/L乙酸铊溶液2.5m1，青霉素G钾盐溶液(20万U／m1)0.5m1和两性霉素B溶液(5mg/ml)0.1m1；充分混匀后倾注9cm平板，经37℃培养过夜，无菌试验阴性者，存放4℃冰箱备用。
注：
⑴ 乙酸铊是极毒药品，须特别注意安全操作。
⑵ 支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长，肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落。
⑶
支原体传代、移种用0.1%半固体琼脂，配制时除用0.1%琼脂粉外，其它成分与支原体基础培养基相同，但不加两性霉素，此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块，直接移种于半固体管中，置适当的气体环境中，培养3~5天后，可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物，或呈颗粒状，即次代支原体。
⑷ 支原体传代用液体培养基：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加琼脂粉和两性霉素B。
2.肺炎支原体分离用双相培养基
[用途]
用于喉拭标本直接分离肺炎支原体。
[配法]
⑴ 底层琼脂斜面：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加两性霉素B。无菌分装于经灭菌的链霉素空瓶中，每瓶3m1，置成斜面，此为底层。
⑵
液体培养基：其成分与上述支原体传代用液体培养基相同。但在未高压灭菌前，再加入葡萄糖1g，美蓝0.001g(即10g/L美蓝溶液0.1ml)，1g/L酚红溶液2m1，115℃灭菌15min，冷却后，再加入辅助成分和防止杂菌生长的成分。然后，在上述底层琼脂斜面上，每瓶再加入液体培养基3~5m1，瓶塞用煮沸灭菌的后口橡皮塞。经37℃培养过夜，无菌试验阴性者，存放4℃冰箱中备用，可保存1月。
注：已接种的双相培养管，培养37℃普通环境2~4周，观察结果，阳性生长见双相管由淡紫色变成绿色，再转变为黄色,因肺炎支原体发酵葡萄糖，还原美蓝。取阳性管用分离支原体固体平皿分离菌落，平血放入含95
%氮气和5 %二氧化碳环境中，或放入含5% 二氧化碳环境中培养2~4周，阳性平皿可见菌落生长。
三、衣原体培养基－鸡胚培养基
[用途]
培养增殖和分离鹦鹉热、性病淋巴肉芽肿和沙眼等衣原体。
[配法]
7日龄鸡胚3~5只。
精选产后10天内并10℃左右保存的受精鸡卵孵育，置38~39℃、相对湿度40%~60%的孵卵箱中孵育，4天后用检卵灯检视发育情况，挑出未受精及死亡者。生活鸡胚检视时可见清晰血管小团或花纹，其中有鸡胚暗影，稍大者并见胚动等。将感染材料研磨合并，加含抗菌药物的肉汤制成l0%~20%
的悬液，室温中置1h后，接种鸡胚卵黄囊0.25m1，每份标本接种3~4只鸡胚，置35℃培养，每日观察1次。3天以后死亡的鸡胚收获其卵黄囊，先做涂片染色，检选疑似或阳性材料再行传代，直到含有丰盛衣原体。
注：
⑴ 如感染后13天鸡胚仍然存活，再行
盲目传代。先将鸡胚在4℃冰箱中放几小时，然后解剖黄囊，研碎后制成悬液，低速离心，取上清液接种鸡胚。如连续3代阴性，为阴性结果。
⑵ 待检标本于室温不宜久置，如1h内不能接种，可放普通冰箱中;如放置-70℃低温中，则可保存较长时间。
