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天然RNA文库筛选与蛋白特异性结合的RNA序列实验

2019.9.12

           

实验方法原理 细胞中,蛋白质与 RNA 结合参与多种生理调控和发育过程。在 mRNA 的加帽,多聚腺苷酸化,剪切,核外运,翻译起始及降解等过程中都存在着蛋白质与 RNA 的直接相互作用。在发育的各个阶段,RNA 结合蛋白可以通过与 mRNA 的相互作用调控基因的表达。
实验材料

mRNA 寡核苷酸

试剂、试剂盒

工具酶 二硫苏糖醇 无核酸酶去离子水 乙酸钾 PCI 溶液 NT2 缓冲液 KNET 缓冲液

仪器、耗材

微离心管及加样器吸头 Sephadex G-50 柱

实验步骤

一、材料与设备

1. mRNA(购自 Clontech 公司,也可自行纯化获取)。

2. 工具酶:Superscript Ⅱ 反转录酶和缓冲液(Life Technologies 公司),E.coli RNase H(Life Technologies 公司),未端脱氧核糖核酸转移酶(Td Tase)和缓冲液(Life Technologies 公司),RNasin RNase 抑制剂(Promega 公司),Taq 酶。

3. 合成寡核苷酸(这里仅给出个例子):

正向引物 [ oligo-dG ]:5'-ACCAGGATCCTAATACGACTCACTATA [ G ]11-3'

反向引物 [ oligo-dT ]:5'-CATGGAATTCGGATCC [ T ]15-3'

dNTP 混合物:10 mmol/L(dATP、dCTP、dGTP、dUTP 均为 10 mmol/L)。

NTP 混合物:10 mmol/L(ATP、CTP、GTP、UTP 均为 10 mmol/L)。

4. 0.1 mol/L 二硫苏糖醇。

5. 无核酸酶的 0.5 ml 或 1.5 ml 微离心管及加样器吸头。

6. 无核酸酶去离子水。

7. Sephadex G-50 柱。

8. 蛋白 A-sepharose 凝胶珠(P3391,Sigma 公司)。

9. 3 mol/L 乙酸钾(pH 5.2 ),100% 和 70% 乙醇,7.5 mol/L 乙酸铵,0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0),3 mol/L 乙酸钠(pH 5.2)。

10. PCI 溶液:酚:氯仿:异戊醇(25 : 24 : 1,体积比),用 10 mmol/L Tris-HCl ( pH 8.0 )、1 mmol/L EDTA ( pH 8.0) 平衡。

11. NT2 缓冲液:50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4 ),150 mmol/L NaCl,0.05% NP-40,1 mmol/L MgCl2

12. KNET 缓冲液:20 mmol/L KCl,80 mmol/L NaCl,2 mmol/L EGTA,50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.4),0.05% NP-40,5 mg/ml mRNA,1 mmol/L MgCl2,2.5% 聚乙烯醇,0.2% 核苷氧钒复合物(vanadyl ribonucleoside complex,VCR),0.1 mg/ml 牛血清白蛋白,0.5 mg/ml 酵母 tRNA,10 mmoI/L DTT,80 U/ml RNasin。临用前配制。



二、操作方法

实验分 5 步进行:首先,用 oligo-dT 引物对 mRNA 进行反转录;然后在末端脱氧核糖核酸转移酶的作用下在合成的 cDNA 末端合成 C 尾;进而进行 PCR 扩增反应,在与 C-尾配对的 oligo-dG 引物中含有 T7 RNA 聚合酶启动子序列;扩增获得的 cDNA 再反转录合成 RNA;最后用靶蛋白质进行 RNA 文库的筛选工作。

1. 反转录 mRNA 合成 cDNA

(1) 在 13 μl 预处理的水中加入 1~5 μg mRNA,1 μl(0.5 μg)oligo-dT 引物,轻轻混匀。

(2) 反应管于 70℃ 反应 10 min,冰上放置 1 min,瞬时离心,加入 2 μl 10X 反转录酶缓冲液、1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液、2 μl 0.1 mol/L DTT、1 μl Superscript Ⅱ 反转录酶(200 U/μl),总体积 20 μl。

(3) 轻轻混匀后离心反应管,室温放置 10 min。

(4) 将反应管于 42°C 反应 50 min。70℃ 孵育 15 min 终止反应,将反应管转移至冰上。

(5) 离心收集产物,加 1 μl E.coli RNase H(2 U/μl),37℃ 孵育 20 min。

(6) 将反转录产物通过 Sephadex G-50 柱去除残余未反应的核苷酸。

(7) 加入 0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钾,乙醇沉淀单链 DNA。

2. 在 cDNA 库末端加 C-同聚尾

(1) 用水重悬 cDNA(3' 末端浓度约为 40 pmol/ml)。

(2) 在 1.5 ml 离心管内进行末端脱氧核糖核酸转移反应:10 μl 5X TdT 缓冲液,25 μl 100 μmol/L dCTP,cDNA,48.5 μl 水,1.5 μl (15U) TdTase;37℃ 反应 30 min。

(3) 将反应管置冰上,加入 10 μl 0.1 mol/L Na2EDTA ( pH 8.0 ) 终止反应。

(4) 加 60 μl PCI,充分混匀,15000 g 室温离心 5 min。

(5) 取上层水相,通过 Sephadex G-50 柱去除未反应的 dCTP。

(6) 0.5 倍体积 7.5 mol/L 乙酸铵,2.5 倍体积乙醇沉淀 DNA。

(7) 14000 g 室温离心 30 min,小心去除上清。

(8) 50 μl 水重悬 cDNA,20℃ 保存。

3. PCR 扩增 cDNA 库

(1) 反应混合液:41.5 μl 水,10 μl 10X PCR 缓冲液,2 μl dNTP 混合液,1 μl 0.1 μg/μl oligo-dG 引物,1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物,1 μl 加 C-同聚尾的 cDNA,0.5 μl 5 U/ml Taq 酶。反应条件:94°C,1 min;50℃,1 min;72℃,2 min;25 个循环,然后 72℃,7 min。

(2) 1 μl 20U/μl Bam HI (或其他在引物设计时引入的内切酶,以去除 PCR 过程中可能产生的多聚体),37℃ 反应 1 h。

(3) PCI 抽提,0.1 倍体积 3 mol/L 乙酸钠、2.5 倍体积无水乙醇在干冰/乙醇浴中沉淀 DNA 20 min。

(4) 12000 g 4℃ 离心 10 min,小心去除上清。

(5) 70% 乙醇洗盐,离心去上清,干燥后用 15 μl 水重悬核酸。

(6) 1% 琼脂瑭凝胶电泳,切取 200~800 bp 的 DNA 片断。

(7) 纯化经过凝胶回收的 DNA,PCI 抽提,2.5 倍体积无水乙醇沉淀(冰浴 10 min )。12000 g 4°C 离心 15 min,小心去除上清。70% 乙醇洗盐,离心去上清,干燥后用 20 μl DEPC-H2O 重悬核酸。

4. cDNA 库转录获得 3' UTR 文库

(1) 反应混合液:0.1 μg PCR 扩增得到的 cDNA 库,4 μl 5X T7 或 SP6 RNA 聚合酶缓冲液,8 μl NTP,1 μl 40 U/μl RNasin,1 μl T7 RNA 聚合酶,加 DEPC-H2O 至 20 μl。37℃ 反应 10 min。

(2) 按上一部分的操作使 RNA 沉淀并用 70% 乙醇洗盐。将获得的 RNA 样品重悬于 20 μl DEPC-H2O。

(3) 取 2 μl 3% 琼脂糖凝胶电泳观察。

5. 用蛋白对 3' UTR 文库进行筛选

(1) 蛋白对 3' UTR 文库的结合

① 取 1 mg 蛋白 A-sepharose 凝胶珠,在 1.5 ml 离心管内用 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

② 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液,加入 2 μl 抗血淸。

③ 4°C 混匀至少 10 min。

④ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

⑤ 最后一次洗后留 100 μl 缓冲液,加入 5 μl 0.5 μg/ml 纯化蛋白,4℃ 混匀至少 10 min。

⑥ 1 ml NT2 缓冲液洗 3 次。

⑦ 用 100 μl 新配制的 KNET 缓冲液重悬蛋白 A-sephrose 凝胶珠/抗血清/蛋白。

⑧ 加入 4~5 μl 的 RNA。

⑨ 室温混匀 5 min。

⑩ 1 ml NT2 缓冲液洗 5 次。

⑾ 最一次洗后留 100 μl 缓冲液,加入 100 μl 水。

⑿ 200 μl PCI 抽提。

⒀ 加 2 μl 1 mol/L MgCl2(或 10 mmol/L tRNA ),20 μl 3 mol/L 乙酸钠,700 μl 无水乙醇沉淀。

⒁ 70% 乙醇洗盐,室温干燥。

⒂ 14 μl DEPC-H2O 重悬。

(2) 反转录筛选获得 3'-UTR

① 在 14 μl DEPC-H2O 重悬的 RNA 中加 1 μl 0.1 μg/μl oligo-dT 引物,10X 反转录缓冲液,1 μl 10 mmol/L dNTP 混合液,2 μl 0.1 mol/L DTT,1 μl Superscript II 及转录酶(200 U/μl )。室温孵育 5 min,42℃ 反应 50 min。

② 72℃ 反应 15 min 终止反应,将反应管转移至冰上。

③ 将反应管离心,加入 1 μl 2 U/μl E.coli RNase H,37°C 反应 20 min。

④ 将反应产物过 Sephadex G-50 柱两次,彻底去除未反应的核苷酸。

⑤ 取 6 μl cDNA 产物进行 PCR 扩增(重复 PCR,反转录和筛选试验直至获得最终结果)。

如果采用高严谨性的筛选方法,可以只进行一次结合筛选操作。高严谨性的结合筛选条件包括提高盐浓度(可高至 350 mmol/L),增加漂洗缓冲液中尿素的浓度(0.5~4 mol/L)。使用高严谨性条件进行一次结合筛选的优点除了省时省力之外,最重要的是可以降低由于 PCR 引入的错误。

可以在进行转录时加入同位素标记,比较同样量筛选获得的 3'-UTR 和最初的 3'-UTR 库能够被蛋白沉淀的同位素活性,判断是否筛选得到了特异性的蛋白结合 RNA。筛选得到的克隆可以通过 PCR 扩增时引入的限制酶位点克隆到 PGEM 或 pSP64 质粒中。挑单克隆抽提质粒,测序,进行 BLAST 分析。

这里介绍的是从大量天然存在的 mRNA 3'-UTR 库中筛选 RNA 结合蛋白的作用靶的方法。一定要注意将筛选得到的结果与生物学功能相联系。如果某蛋白与一已知靶 RNA 的 RNA 结合蛋白高度同源,可以考虑直接检测此蛋白是否也具有结合同一靶 RNA 的能力。如果从随机 RNA 文库中筛选得到一定的位点规律,也可以应用于按照规律寻找已知蛋白的其他靶标 RNA。在体外实验确证蛋白与 RNA 间的相互作用后还需要用体内方法(梯度离心,免疫共沉淀结合 Northern 杂交,RT-PCR,RNase 保护法等)进行进一步确认。

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