分子生物学常用实验技术（page 2)

一、RNA 制备
　　模板mRNA 的质量直接影响到cDNA 合成的效率。由于mRNA 分子的结构特点,容易受RNA 酶的攻击反应而降解,加上RNA 酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA 酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA 酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2 小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC 是RNA 酶的化学修饰剂,它和RNA 酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC 与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

　　试验所用试剂也可用DEPC 处理,加入DEPC 至0.1%浓度,然后剧烈振荡10 分钟,再煮沸15 分钟或高压灭菌以消除残存的DEPC,否则DEPC 也能和腺嘌呤作用而破坏mRNA 活性。但DEPC 能与胺和巯基反应,因而含Tris 和DTT 的试剂不能用DEPC 处理。Tris 溶液可用DEPC 处理的水配制然后高压灭菌。配制的溶液如不能高压灭菌,可用DEPC 处理水配制,并尽可能用未曾开封的试剂。除DEPC 外,也可用异硫氰酸胍、钒氧核苷酸复合物、RNA 酶抑制蛋白等。此外,为了避免mRNA 或cDNA 吸附在玻璃或塑料器皿管壁上,所有器皿一律需经硅烷化处理。
细胞内总RNA 制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等。许多公司有现成的总RNA 提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。分离的总RNA 可利用mRNA 3'末端含有多聚(A)+ 的特点,当RNA 流经oligo (dT)纤维素柱时,在高盐缓冲液作用下,mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素上,然后逐渐降低盐浓度洗脱,在低盐溶液或蒸馏水中,mRNA 被洗下。经过两次oligo(dT)纤维素柱,可得到较纯的mRNA。纯化的mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。

二、cDNA 第一链的合成
　　所有合成cDNA 第一链的方法都要用依赖于RNA 的DNA 聚合酶(反转录酶)来催化反应。目前商品化反转录酶有从禽类成髓细胞瘤病毒纯化到的禽类成髓细胞病毒(AMV)逆转录酶和从表达克隆化的Moloney 鼠白血病病毒反转录酶基因的大肠杆菌中分离到的鼠白血病病毒(MLV)反转录酶。AMV 反转录酶包括两个具有若干种酶活性的多肽亚基,这些活性包括依赖于RNA 的DNA 合成,依赖于DNA 的DNA 合成以及对DNA:RNA 杂交体的RNA 部分进行内切降解(RNA 酶H 活性)。MLV 反转录酶只有单个多肽亚基,兼备依赖于RNA 和依赖于DNA 的DNA 合成活性,但降解RNA NA 杂交体中的RNA 的能力较弱,且对热的稳定性较AMV 反转录酶差。MLV 反转录酶能合成较长的cDNA(如大于2-3kb)。AMV反转录酶和MLV 反转录酶利用RNA 模板合成cDNA 时的最适pH 值,最适盐浓度和最适温室各不相同,所以合成第一链时相应调整条件是非常重要。AMV 反转录酶和MLV 反转录酶都必须有引物来起始DNA 的合成。cDNA 合成最常用的引物是与真核细胞mRNA 分子3'端poly(A)结合的12-18 核苷酸长的oligo(dT)。

三、cDNA 第二链的合成
　　cDNA 第二链的合成方法有以下几种:
(1) 自身引导法合成的单链cDNA 3'端能够形成一短的发夹结构,这就为第二链的合成提供了现成的引物,当第一链合成反应产物的DNA:RNA 杂交链变性后利用大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ Klenow 片段或反转录酶合成cDNA 第二链,最后用对单链特异性的S1 核酸酶消化该环,即可进一步克隆。但自身引导合成法较难控制反应，而且用S1 核酸酶切割发夹结构时无一例外地将导致对应于mRNA 5'端序列出现缺失和重排,因而该方法目前很少使用。
(2) 置换合成法该方法利用第一链在反转录酶作用下产生的cDNA:mRNA 杂交链不用碱变性,而是在dNTP 存在下,利用RNA 酶H 在杂交链的mRNA 链上造成切口和缺口。从而产生一系列RNA 引物,使之成为合成第二链的引物,在大肠杆菌DNA 聚合酶Ⅰ的作用下合成第二链。该反应有3 个主要优点: (1) 非常有效; (2) 直接利用第一链反应产物,无须进一步处理和纯化; (3) 不必使用S1 核酸酶来切割双链cDNA 中的单链发夹环。目前合成cDNA 常采用该方法。

四、cDNA 的分子克隆
　　已经制备好的双链cDNA 和一般DNA 一样,可以插入到质粒或噬菌体中,为此,首先必需连接上接头(Linker),接头可以是限制性内切酶识别位点片段,也可以利用末端转移酶在载体和双链cDNA的末端接上一段寡聚dG 和dC 或dT 和dA 尾巴,退火后形成重组质粒,并转化到宿主菌中进行扩增。合成的cDNA 也可以经PCR 扩增后再克隆入适当载体。

第二节动植物组织mRNA 提取
一、材料
　　 水稻叶片或小鼠肝组织。

二、设备
　　研钵，冷冻台式高速离心机，低温冰箱，冷冻真空干燥器，紫外检测仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂
1、无RNA 酶灭菌水：用将高温烘烤的玻璃瓶（180℃ 2 小时）装蒸馏水，然后加入0.01%的DEPC（体积/体积），处理过夜后高压灭菌。
2、75%乙醇：用DEPC 处理水配制75%乙醇，（用高温灭菌器皿配制），然后装入高温烘烤的玻璃瓶中，存放于低温冰箱。
3、1×层析柱加样缓冲液；20mmol/L Tris?Cl(pH7.6)，0.5mol/L NaCl，1mmol/L EDTA(pH8.0)，0.1% SDS。
4、洗脱缓冲液：10mmol/L Tris?Cl (pH7.6)，1mmol/L EDTA (pH8.0)，0.05% SDS。

四、操作步骤
（一）动植物总RNA 提取-Trizol 法
　　Trizol 法适用于人类、动物、植物、微生物的组织或培养细菌，样品量从几十毫克至几克。用Trizol法提取的总RNA 绝无蛋白和DNA 污染。RNA 可直接用于Northern 斑点分析，斑点杂交， Poly(A)+分离，体外翻译，RNase 封阻分析和分子克隆。
1、将组织在液N 中磨成粉末后，再以50-100mg 组织加入1ml Trizol 液研磨，注意样品总体积不能超过所用Trizol 体积的10%。
2、研磨液室温放置5 分钟，然后以每1mlTrizol 液加入0.2ml 的比例加入氯仿，盖紧离心管，用手剧烈摇荡离心管15 秒。
3、取上层水相于一新的离心管，按每mlTrizol 液加0.5ml 异丙醇的比例加入异丙醇，室温放置10 分钟，12000g 离心10 分钟。
4、弃去上清液，按每ml Trizol 液加入至少1ml 的比例加入75%乙醇，涡旋混匀，4℃下7500g离心5 分钟。
5、小心弃去上清液，然后室温或真空干燥5-10 分钟，注意不要干燥过分，否则会降低RNA 的溶解度。然后将RNA 溶于水中，必要时可55℃-60℃水溶10 分钟。RNA 可进行mRNA 分离，或贮存于70%乙醇并保存于-70℃。
[注意] 1、整个操作要带口罩及一次性手套，并尽可能在低温下操作。
　　　　2、加氯仿前的匀浆液可在-70℃保存一个月以上，RNA 沉淀在70%乙醇中可在4℃保存一周，-20℃保存一年。

（二）mRNA 提取
　　由于mRNA 末端含有多poly(A)+，当总RNA 流径oligo(dT)纤维素时，在高盐缓冲液作用下，
mRNA 被特异的吸附在oligo(dT)纤维素柱上，在低盐浓度或蒸馏水中，mRNA 可被洗下，经过两次
oligo(dT) 纤维素柱，可得到较纯的mRNA。

1、用0.1mol/L NaOH 悬浮0.5-1.0g oligo(dT)纤维素。
2、将悬浮液装入灭菌的一次性层析柱中或装入填有经DEPC 处理并经高压灭菌的玻璃棉的巴斯
德吸管中，柱床体积为0.5-1.0ml，用3 倍柱床体积的灭菌水冲洗柱床。
3、用1x 柱层析加样缓冲液冲洗柱床，直到流出液的pH 值小于8.0。
4、将（一）中提取的RNA 液于65℃温育5 分钟后迅速冷却至室温，加入等体积2x 柱层析缓冲
液，上样，立即用灭菌试管收集洗出液，当所有RNA 溶液进入柱床后，加入1 倍柱床体积的1x 层析
柱加样溶液。
5、测定每一管的OD260，当洗出液中OD 为0 时，加入2-3 倍柱床体积的灭菌洗脱缓冲液，以
1/3 至1/2 柱床体积分管收集洗脱液。
6、测定OD260，合并含有RNA 的洗脱组分。
7、加入1/10 体积的3M NaAc(pH5.2)， 2.5 倍体积的冰冷乙醇， 混匀， -20℃30 分钟。
8、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心
5 分钟。
9、小心弃去上清液，沉淀空气干燥10 分钟，或真空干燥10 分钟。
10、用少量水溶解RNA 液，即可用于cDNA 合成（或保存在70%乙醇中并贮存于-70℃）。
[注意] 1、mRNA 在70%乙醇中-70℃可保存一年以上。
　　　2、oligo(dT)纤维素柱用后可用0.3mol/l NaOH 洗净，然后用层析柱加样缓冲液平衡，并加入0.02%叠氮钠（NaN3)冰箱保存，重复使用。每次用前需用NaOH 水层析柱加样缓冲液依次淋洗柱床。第三节植物病毒RNA 提取大多植物病毒RNA 为单链RNA，并且其极性与mRNA 极性相同，植物病毒RNA 提取较为简单，一般使用酚氯仿即可获得满意结果。

一、材料
　　提纯TMV 病毒液（10mg/ml）。

二、设备
　　冷冻台式离心机，低温真空干燥仪，电泳仪，电泳槽。

三、试剂
　　TE-饱和酚:氯仿（1:1），氯仿，3M NaAc(pH5.2)，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液，无RNA 酶的双菌水。

四、操作步骤
1、取一eppendorf 管加入提纯TMV（10mg/ml)400ml，再加入等体积酚/氯仿，盖紧管盖后用手充分振荡1 分钟，4℃下12000g 离心10 分钟。
2、吸取水相于一新eppendorf 管，再用酚/氯仿抽提，直至水相和有机相交界面无蛋白为止。
3、吸取水相于新eppendorf 心管，加入等体积氯仿，用手倒置离心管数十秒，4℃下12000g 离心10 分钟。
4、取水相，加入1/10 倍体积的3mol/L NaAc(pH5.2)，2.5 倍体积的冰冷乙醇，混匀，-20℃30分钟。
5、4℃下12000g 离心15 分钟，小心弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀，4℃下12000g 离心5分钟。
6、小心弃去上清液，沉淀真空干燥5 分钟或空气干燥10 分钟，并溶于无RNA 酶的双菌水或TE缓冲液中。
7、取10ml 进行电泳分析，另10ml 用于cDNA 合成。
[注意] 1、整个操作应尽可能在低温下进行。
　　　 2、由于病毒RNA 镶嵌于外壳蛋白里面，因此要充分剥去病毒外壳蛋白，一般需要多次进行酚/氯仿的抽提。

第四节cDNA 合成技术
一、Riboclone M-MLV(H- ) cDNA 合成技术
　　Promega 公司的RibocloneR M-MLV(H- ) cDNA 合成系统采用M-MLV 反转录酶的RNase H 缺失突变株取代AMV 反转录酶,使合成的cDNA 更长。该系统的第一链合成使用M-MLV 反转录酶,cDNA 第二链合成采用置换合成法,采用RNaseH 和DNA 聚合酶Ⅰ进行置换合成,最后用T4 DNA 聚合酶切去单链末端,方法简便易行。该系统试剂包括：
　　20μg 特异性引物
　　200μl M-MLV 第一链缓冲液(5×)，配方如下: 250mmol/L Tris?Cl pH8.3(37℃时); 375mmol/l KCl;
　　15mmol/L MgCl2; 50mmol/L DTT; 10mmol/L dATP, dCTP, dGTP, dTTP 混合物(各2.5mmol/L)
　　2×625μ rRNasinR RNA 酶抑制剂
　　10,000μ M-MLV 反转录酶, RNase H-5μg 对照RNA
　　400μl M-MLV 第二链缓冲液(10×)，配方如下：
　　400mmol/L Tris?Cl ,pH7.2; 850mmol/L KCl; 44mmol/L MgCl2;
　　30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
　　500μ RNase H
　　500μ DNA 聚合酶Ⅰ
　　100μ T4 DNA 聚合酶Ⅰ
　　2×1.25ml 不含核酸酶的水
　　以上所有试剂除对照RNA 需在-70℃保存外,其余均可保存于-20℃,可以合成40μg mRNA。

（一） 第一链合成
1. 试剂
　　[α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol)，EDTA (50mM 和200mM)，TE-饱和酚:氯仿（1:1），7.5M NH4Ac，乙醇(100%和70%)，TE 缓冲液。
2. 操作步骤
　　(1) 取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf 管,加入RNA 模板和适当引物,每μg RNA 使用0.5μg 引物(如使用NotⅠ引物接头,使用0.3μg),用H2 O 调整体积至15μl, 70℃处理5 分钟,冷却至室温,离心使溶液集中在管底,再依次加入5×第一链缓冲液5μlrRNasin RNA 酶抑制剂25UM-MLV(H- )反转录酶200UH2 O 调至总体积25μl
　　(2) 用手指轻弹管壁,吸取5μl 至另一eppendorf 管，加入2-5μCi [α-32 P] dCTP (>400Ci/mmol),
用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
　　(3) 37℃(随机引物)或42℃(其它引物)温浴1 小时
　　(4) 取出置于冰上
　　(5) 掺入测定的eppendorf 管加入95μl 50mM EDTA 终止反应,并使总体积为100μl。可取90μl 进行电泳分析(先用苯酚抽提),另10μl 进行同位素掺入放射性活性测定。第一链合成eppendorf 管可直接用于第二链合成
　　注：以上25μl 反应总体积中所用RNA 量为1μg,如合成5μg RNA,则可按比例扩大反应体积, 倒5μg RNA 使用125μl 总体积进行合成。

（二） 第二链合成
1、取第一链反应液20μl, 再依次加入10×第二链缓冲液20μ　　lDNA 聚合酶Ⅰ 23μ　　RNase H 0.8μH2O 　　加至终体积为100μl
2、轻轻混匀,如需进行第二链同位素掺入放射性活性测定,可取出10μl 至另一eppendorf 管,加入2-5μCi[α-32 P] dCTP。
3、14℃温浴2 小时(如需合成长于3kb 的cDNA, 则需延长至3-4 小时)。
4、掺入测定eppendorf 管中加入90μl 50mM EDTA, 取10μl 进行同位素掺入放射性测定,余下的可进行电泳分析。
5、cDNA 第二链合成离心管反应液70℃处理10 分钟, 低速离心后置冰上。
6、加入2μ T4 DNA 聚合酶, 37℃温浴10 分钟。
7、加入10μl 200mmol/L EDTA 终止反应。
8、用等体积酚:氯仿抽提cDNA 反应液,离心2 分钟。
9、水相移至另一eppendorf 管,加入0.5 倍体积的7.5M 醋酸铵(或0.1 倍体积的1.5M 醋酸钠,pH5.2), 混匀后再加入2.5 倍体积的冰冷乙醇(-20℃), -20℃放置30 分钟后离心5 分钟。
10、小心丢去上清液,加入0.5ml 冰冷的70%乙醇,离心2 分钟。
11、小心移去上清液,干燥沉淀。
12、沉淀溶于10-20μl TE 缓冲液。

（三）同位素掺入放射性活性测定、计算和电泳分析
1. 试剂
　　1mg/ml 鲑鱼精DNA， 三氯乙酸(TCA, 5%和7%)，碱性琼脂糖胶，碱性胶电泳缓冲液，（ 30mMNaOH，1mM EDTA），2×样品缓冲液，（20mM NaOH，20% 甘油，0.025%溴酚蓝）。
2. 操作步骤
(1) 各取一2(5)中和二(4)反应液各3μl,点于玻璃纤维滤纸,室温干燥, 这些样品代表总放射性活性。
(2) 同样各取3μl 中反应液至含有100μl(1mg/ml)鲑鱼精DNA 中,混匀,加入0.5ml 5% TCA, 涡旋混合仪混合后置冰上5-30 分钟。
(3) 用玻璃纤维滤纸过滤,用冰冷的5% TCA 洗三次,每次用5ml TCA,再用5ml 丙酮或乙醇漂洗,这些样品代表掺入放射性活性。
(4) 分别测定总放射性活性强度和掺入放射性活性强度,可用盖革计算器,也可用液闪计数。
3. 第一链产量测定
第一链掺入率(%)= 掺入cpm/总cpm ×100%
掺入dNTP(nmol)=2nmol dNTP/μl ×反应体积(μl)×(第一链掺入率)
设330 为每mol dNTP 的平均分子量
合成cDNA 量(ng)=掺入dNTP (nmol)×330ng/nmol
mRNA 向cDNA 转变率=合成cDNA 量(ng) / 模板RNA 量(ng)×100%
例如总放射性活性强度为254,000cpm, 掺入放射性活性强度为3040cpm, 所用RNA 摸板量为1μg,反应体积为25μl, 则:
掺入率＝3040/254000×100%=1.2
掺入dNTP 量=2nmol dNTP/μl×25×1.2%=0.6nmol
合成cDNA 量=0.6nmol dNTP×330ng/nmol=198ng
mRNA 向cDNA 转变率=198nm/1000ng×100%=19.8%
由于1000ng RNA 中20%(5μl/25μl)用于掺入测定,而反应体积占总体积80%,因而实际第一链cDNA 合成量为0.8×198ng=158ng。
4. 第二链产量计算
除需去除第一链掺入dNTP 外,方法同第一链产量计算
第二链掺入率= 掺入放射性活性/ 总放射性活性??
掺入dNTP 量(nnol)=[0.4nmol dNTP/μl×反应体积(μl)－第一链掺入nmol]×第二链掺入率
第二链cDNA 合成量(ng)=nmol dNTP×330ng/nmol
双链cDNA 转变率=双链cDNA 合成量(ng)/ 单链cDNA 合成量(ng)
例: 第二链掺入放射性活性强度为2780cmp, 总放射性活性强度为235000cpm.
第二链掺入率=2780/235000×100%=1.18%
第二链合成dNTP 量=[(0.4nmol/μl×100μl)－0.48nm]×1.18% =0.47nmol
合成第二链cDNA 量(ng)=0.47nmol×330ng/nmol =155ng
双链cDNA 转变率=155ng /158ng×100%=98%
一般cDNA 第一链转变率和双链转变率以12-50%和50-200%为好。

（四） 电泳分析
　　通常合成的cDNA 第一链和第二链长度为350-6000 碱基,需进行1.4%碱性琼脂糖电泳。将第一链和第二链掺入测定管中的反应液先用酚抽提,乙醇沉淀，方法见本章（二）第二链合成中的9-12 步，一般第一链和第二链上样量相同。

1. 标准分子量DNA 参照物的同位素标记
(1) 通常使用λDNA/HindⅢ片段,用Klenow DNA 聚合酶进行32 P 标记
10×HindⅢ缓冲液2.5μl
dATP 0.2mmol/L
dGTP 0.2mmol/L
[α-32 P]dCTP(400Ci/mmol) 2μCi
λDNA/HindⅢ标准DNA 1μg
Klenow DNA 聚合酶1μ
加H2O 到总体积25μl
(2) 室温放置10 分钟, 加2.5μl 200mM EDTA 终止反应, 加入2×样品缓冲液,贮存于-20℃。
2. 电泳分析
(1) 用50mM NaCl, 1mM EDTA 制备1.4%的碱性琼脂糖电泳, 并置碱性电泳缓冲液中30 分钟。
(2) 取样品液, 用TE 调整体积, 使第一链和第二链产率测定液的体积相同,加入等体积的2×样品缓冲液(20mmol/L NaOH, 20%甘油，0.025%溴粉兰）。
(3) 加样,电泳到染料距前沿线只剩胶长度的1/3 处，电泳缓冲液为30mmol/L NaOH, 1mmol/LEDTA。
(4) 将胶浸入7% TCA 中,室温放置30 分钟(直至染料由蓝色变至黄色),取出置滤纸上,干燥数小时。
(5) 用保鲜膜包裹干燥的胶,室温压X 光片(用增感屏时-70℃压片)。

二、其它cDNA 合成技术
　　除Riboclone M-MLV(H-)cDNA 合成技术外，Promega 公司还提供有多个AMV 合成试剂盒，不同试剂盒所提供的引物或引物一延接头(Primpr-Adaptor)不同，有oligo(dT)15 引物、随机引物、XbaⅠ引物-延接头、NotⅠ引物-延接头等，其余试剂一样，这些系统包括：
20mg 引物
20ml 5×第一链缓冲液, 配方如下：
250mmol/L Tris?Cl,pH8.3(42℃);250mmol/L KCl;50mmol/L
MgCl2; 2.5mmol/L 亚精胺(Spermidine); 50mmol/L DTT;
20mmol/L dATP, dCTP,dGTP,dTTP(各5mmol/L)。
50ml 40mM 焦碳酸钠
625m rRNasin RNA 酶抑制剂
600m AMV 反转录酶
5mg 1.2kb 对照RNA
200ml 10×第二链缓冲液，配方如下：
400mmol/L Tris?Cl,pH7.2; 900mmol/L KCl; 30mmol/L
MgCl2; 30mmol/L DTT; 0.5mg/ml BSA。
2m E.Coli RNaseH
500m E.ColiDNA PolymeraseⅠ
100m T4 DNA PolymeraseⅠ
1.5ml 不含核酸酶的水
以上所有试剂除对照RNA 需在-70℃保存外，其余均可保存于-20℃，可以合成40mgmRNA。

（一）第一链合成
　　下面介绍的是25ml 体积反应系统，该系统可合成多至2mgmRNA，每增加1mg mRNA，需增加反应体积10ml，如5mg mRNA 需55ml 反应体积。引物或引物-延接头和反转录酶与mRNA 的比例应分别保持为0.5mg/mg（对NotⅠ引物-延接头
为0.3mg/mg）和15m/mg.
1、试剂：
[a-32P]dCTP（>400ci/mmol)，EDTA(50mM 和200mM)，TE 饱和酶/氯仿，7.5mM NH4Ac，100%和70%乙醇，TE 缓冲液(10mM Tris?Cl,pH8.0,1mm EDTA)。
2、操作步骤：
（1）取一灭菌的无RNA 酶的eppendorf 管加入的RNA 样品，及引物或引物-延接头，用H2O 调节0.5mg 引物/mg mRNA（或0.3mg NotⅠ引物-延接头/mg mRNA）的体积至15ml，70℃加热5 分钟，待冷至室温，离心数秒钟使溶液集中在管底，然后依次加入：
5×第一链缓冲液5mlrRNasinR RNA 酶抑制剂25ml
40mM 焦碳酸钠2.5ml
AMV 反转录酶15m/mg RNA
加无水RNA 酶水至总体积25ml
　　在加入焦碳酸钠和AMV 反转录酶前，需将反应液42℃温浴5 分钟，以阻止焦碳酸钠沉淀。焦碳酸钠主要用于抑止第一链形成发夹结构。
（2）轻弹eppendorf 管，取出5ml 至另一加于2-5m[a-32P]dCTP c>400ci/mmol）（其体积不能超过1ml），用以第一链同位素掺入放射性活性测定。
（3）42℃温浴1 小时。
（4）取出置冰上。
（5）掺入测定的eppendorf 管加入50mM EDTA，终止反应，并使总体积为100ml。可取90ml进行电泳分析，另10ml 进行同位素掺入测定。
（6）第一链合成离心管可直接用于第二链合成

（二）第二链合成
　　第二链合成可在第一链合成反应液中直接进行。
1、第一链反应液（20ml）中依次加入
10X 第二链缓冲液10ml
E.Coli DNA polymeraseⅠ 23m
E.Coli RNaseH 0.8m
加无核酸酶水至总体积100ml
余下步骤同本章第四节一（二）2-12 步及（三）和（四）。
思考题:
1. 为什么mRNA 提取是cDNA 合成成败的关键？
2. 试比较自导引导法和置换合成法合成cDNA 的优缺点。

第五章重组质粒的连接、转化及筛选

第一节概述

　　质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA 片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA 和目的DNA 片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA 的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。外源DNA 片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种：

1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA 片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA 片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR 扩增时，在DNA 片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。

2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA 均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA 的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA 的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA 的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA 片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli 受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。

3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA 聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA 连接酶的浓度和外源DNA 及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA 分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。特殊情况下，外源DNA 分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA 片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coliDNA聚合酶Ⅰ的klenow 大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。

　　本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp 抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。因pBS 带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA 的转化子才能在含有Amp 的LB 平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。pBS 上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N 端146 个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ 的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS 和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS 和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ 基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS 质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH 下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA 分开。此为α-互补现象筛选。

第二节材料、设备及试剂

一、材料
　　外源DNA 片段: 自行制备的带限制性末端的DNA 溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS 质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM 系列等具有α-互补能力的菌株。
二、设备
　　恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅， 琼脂糖凝胶电泳装置， 电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台， 微量移液枪，eppendorf 管。
三、试剂
1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris?Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L ATP（过滤灭菌）。
2、T4 DNA 连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。
3、X-gal 储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal 配制成20mg/ml 的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。
4、IPTG 储液(200mg/ml): 在800μl 蒸馏水中溶解200mg IPTG 后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm 滤膜过滤除菌，分装于eppendorf 管并储于-20℃。
5、麦康凯选择性培养基(Maconkey Agar)：取52g 麦康凯琼脂加蒸馏水1000ml，微火煮沸至完全浴解，高压灭菌，待冷至60℃左右加入Amp 储存液使终浓度为50mg/ml，然后摇匀后涂板。
6、含X-gal 和IPTG 的筛选培养基：在事先制备好的含50μg/ml Amp 的LB 平板表面加40ml X-gal储液和4μlIPTG 储液,用无菌玻棒将溶液涂匀,置于37℃下放置3-4 小时,使培养基表面的液体完全被吸收。
7、感受态细胞制备试剂: 见第三章。
8、煮沸法快速分离质粒试剂: 见第一章。
9、质粒酶及电泳试剂: 见第二章。

第三节操作步骤

一、连接反应
1、取新的经灭菌处理的0.5ml eppendorf 管, 编号。
2、将0.1μg 载体DNA 转移到无菌离心管中，加等摩尔量(可稍多)的外源DNA 片段。
3、加蒸馏水至体积为8μl,于45℃保温5 分钟,以使重新退火的粘端解链。将混和物冷却至0℃。
4、加入10×T4 DNA ligase buffer 1μl, T4 DNA ligase 0.5μl, 混匀后用微量离心机将液体全部甩到管底,于16℃保温8-24 小时。
同时做二组对照反应，其中对照组一只有质粒载体无外源DNA；对照组二只有外源DNA 片段没有质粒载体。

二、E. coli DH5α感受态细胞的制备及转化
　　每组连接反应混和物各取2μl 转化E. coli DH5α感受态细胞。具体方法见第三章。

三、重组质粒的筛选
1、每组连接反应转化原液取100μl 用无菌玻棒均匀涂布于筛选培养基上,37℃下培养半小时以上,直至液体被完全吸收。
2、倒置平板于37℃继续培养12-16 小时,待出现明显而又未相互重叠的单菌落时拿出平板。
3、放于4℃数小时,使显色完全（此步麦康凯培养基不做）。不带有pBS 质粒DNA 的细胞,由于无Amp 抗性,不能在含有Amp 的筛选培养基上成活。带有pBS载体的转化子由于具有β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯筛选培养基上呈现为红色菌落。在X-gal 和ITPG培养基上为蓝色菌落。带有重组质粒转化子由于丧失了β-半乳糖苷酶活性,在麦康凯选择性培养基和x-gal 和ITPG 培养基上均为白色菌落。

四、酶切鉴定重组质粒
　　用无菌牙签挑取白色单菌落接种于含Amp 50μg/ml 的5ml LB 液体培养基中,37℃下振荡培养12 小时。使用煮沸法快速分离质粒DNA 直接电泳，同时以煮沸法抽提的pBS 质粒做对照，有插入片段的重组质粒电泳时迁移率较pBS 慢。再用与连接未端相对应的限制性内切酶进一步进行酶切检验。还可用杂交法筛选重组质粒。
[注意] 1、DNA 连接酶用量与DNA 片段的性质有关，连接平齐末端，必须加大酶量，一般使用连接粘性末端酶量的10-100 倍。
2、在连接带有粘性末端的DNA 片段时，DNA 浓度一般为2-10mg/ml，在连接平齐末端时，需加入DNA 浓度至100-200mg/ml。
3、连接反应后，反应液在0℃储存数天，-80℃储存2 个月，但是在-20℃冰冻保存将会降低转化效率。
4、粘性末端形成的氢键在低温下更加稳定，所以尽管T4 DNA 连接酶的最适反应温度为37℃，在连接粘性末端时，反应温度以10-16℃为好，平齐末端则以15-20℃为好。
5、在连接反应中，如不对载体分子进行去5'磷酸基处理，便用过量的外源DNA 片段（2-5 倍），这将有助于减少载体的自身环化，增加外源DNA 和载体连接的机会。
6、麦康凯选择性琼脂组成的平板，在含有适当抗生素时，携有载体DNA 的转化子为淡红色菌落，而携有带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落。该产品筛选效果同蓝白斑筛选，且价格低廉。但需及时挑取白色菌落，当培养时间延长，白色菌落会逐渐变成微红色，影响挑选。
7、X-gal 是5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside)以半乳糖苷酶（ b-galactosidase) 水解后生成的吲哚衍生物显蓝色。IPTG 是异丙基硫代半乳糖苷（Isopropylthiogalactoside)，为非生理性的诱导物，它可以诱导lacZ 的表达。
8、在含有X-gal 和IPTG 的筛选培养基上，携带载体DNA 的转化子为蓝色菌落，而携带插入片段的重组质粒转化子为白色菌落，平板如在37℃培养后放于冰箱3-4 小时可使显色反应充分，蓝色菌落明显。

思考题
1. 在用质粒载体进行外源DNA 片段克隆时主要应考虑哪些因素？
2. 利用α－互补现象筛选带有插入片段的重组克隆的原理是什么？

第六章基因组DNA 的提取

第一节概述

　　基因组DNA 的提取通常用于构建基因组文库、Southern 杂交(包括RFLP)及PCR 分离基因等。利用基因组DNA较长的特性,可以将其与细胞器或质粒等小分子DNA分离。加入一定量的异丙醇或乙醇，基因组的大分子DNA 即沉淀形成纤维状絮团飘浮其中, 可用玻棒将其取出，而小分子DNA 则只形成颗粒状沉淀附于壁上及底部, 从而达到提取的目的。在提取过程中,染色体会发生机械断裂,产生大小不同的片段,因此分离基因组DNA 时应尽量在温和的条件下操作,如尽量减少酚/氯仿抽提、混匀过程要轻缓, 以保证得到较长的DNA。一般来说,构建基因组文库, 初始DNA 长度必须在100kb 以上,否则酶切后两边都带合适末端的有效片段很少。而进行RFLP 和PCR 分析, DNA 长度可短至50kb, 在该长度以上,可保证酶切后产生RFLP 片段(20kb 以下),并可保证包含PCR 所扩增的片段(一般2kb 以下)。不同生物（植物、动物、微生物）的基因组DNA 的提取方法有所不同; 不同种类或同一种类的不同组织因其细胞结构及所含的成分不同，分离方法也有差异。在提取某种特殊组织的DNA 时必须参照文献和经验建立相应的提取方法, 以获得可用的DNA 大分子。尤其是组织中的多糖和酶类物质对随后的酶切、PCR 反应等有较强的抑制作用,因此用富含这类物质的材料提取基因组DNA 时, 应考虑除去多糖和酚类物质。本实验以水稻幼苗(禾本科)、李(苹果)叶子、动物肌肉组织和大肠杆菌培养物为材料,学习基因组DNA 提取的一般方法。

第二节从植物组织提取基因组DNA

一、材料
　　水稻幼苗或其它禾本科植物，李（苹果）幼嫩叶子。

二、设备
　　移液器，冷冻高速离心机，台式高速离心机，水浴锅，陶瓷研钵，50ml 离心管（有盖）及5ml
和1.5ml 离心管，弯成钩状的小玻棒。

三、试剂
1、提取缓冲液Ⅰ：100mmol/L Tris?Cl, pH8.0, 20mmol/L EDTA, 500mmol/L NaCl, 1.5% SDS。
2、提取缓冲液Ⅱ：18.6g 葡萄糖，6.9g 二乙基二硫代碳酸钠，6.0gPVP，240ul 巯基乙醇，加水
至300ml。
3、80:4:16/氯仿:戊醇:乙醇
4、RnaseA 母液：配方见第一章。
5、其它试剂：液氮、异丙醇、TE 缓冲液，无水乙醇、70%乙醇、3mol/L NaAc。

四、操作步骤：
（一）水稻幼苗或其它禾木科植物基因组DNA 提取
1. 在50ml 离心管中加入20ml 提取缓冲液Ⅰ, 60℃水浴预热。
2. 水稻幼苗或叶子5-10g, 剪碎, 在研钵中加液氮磨成粉状后立即倒入预热的离心管中, 剧烈摇动混匀, 60℃水浴保温30-60 分钟(时间长,DNA 产量高), 不时摇动。
3. 加入20ml 氯仿/戊醇/乙醇溶液, 颠倒混匀(需带手套, 防止损伤皮肤)，室温下静置5-10 分钟,使水相和有机相分层(必要时可重新混匀)。
4. 室温下5000rpm 离心5 分钟。
5. 仔细移取上清液至另一50ml 离心管,加入1 倍体积异丙醇,混匀,室温下放置片刻即出现絮状DNA 沉淀。
6. 在1.5ml eppendorf 中加入1ml TE。用钩状玻璃棒捞出DNA 絮团,在干净吸水纸上吸干,转入含TE 的离心管中,DNA 很快溶解于TE。
7. 如DNA 不形成絮状沉淀,则可用5000rpm 离心5 分钟, 再将沉淀移入TE 管中。这样收集的沉淀,往往难溶解于TE,可在60℃水浴放置15 分钟以上，以帮助溶解。
8. 将DNA 溶液3000rpm 离心5 分钟, 上清液倒入干净的5ml 离心管。
9. 加入5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃ 10 分钟, 除去RNA(RNA 对DNA 的操作、分析一般无影响，可省略该步骤）。
10. 加入1/10 体积的3mol/L NaAc 及2×体积的冰乙醇,混匀,-20℃放置20 分钟左右,DNA 形成絮状沉淀。
11. 用玻棒捞出DNA 沉淀,70%乙醇漂洗,再在干净吸水纸上吸干。
12. 将DNA 重溶解于1ml TE, -20 贮存。
13. 取2μl DNA 样品在0.7% Agarose 胶上电泳, 检测DNA 的分子大小。同时取15μl 稀释20倍, 测定OD260/OD280, 检测DNA 含量及质量。
[注意] 5g 样品可保证获得500μg DNA, 足供RFLP、PCR 等分析之用。

（二）. 从李(苹果)叶子提取基因组DNA
1. 取3-5 克嫩叶, 液氮磨成粉状。
2. 加入提取缓冲液Ⅱ10ml, 再研磨至溶浆状。10000rpm, 10min。
3. 去上清液,沉淀加提取液Ⅰ20ml, 混匀。65℃, 30-60min, 常摇动。
4. 同本节（一）中步骤3-13 操作。

第三节从动物组织提取基因组DNA
一、材料
　　哺乳动物新鲜组织。

二、设备
　　移液管、高速冷冻离心机、台式离心机、水浴锅。

三、试剂
1、分离缓冲液：10mmol/L Tris?Cl pH7.4, 10mmol/L NaCl, 25mmol/L EDTA。
2、其它试剂：10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉剂)，乙醚，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，无水乙醇及70%乙醇，5mol/L NaCl，3mol/L NaAc，TE。

四、操作步骤:
1. 切取组织5g 左右,剔除结缔组织,吸水纸吸干血液,剪碎放入研钵(越细越好)。
2. 倒入液氮,磨成粉末,加10ml 分离缓冲液。
3. 加1ml 10% SDS, 混匀,此时样品变得很粘稠。
4. 加50ul 或1mg 蛋白酶K, 37℃保温1-2 小时, 直到组织完全解体。
5. 加1ml 5mol/L NaCl, 混匀,5000rpm 离心数秒钟。
6.取上清液于新离心管，用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提。待分层后,3000rpm 离心5 分 钟。
7. 取上层水相至干净离心管, 加2 倍体积乙醚抽提(在通风情况下操作)。
8. 移去上层乙醚,保留下层水相。
9. 加1/10 体积3mol/L NaAc, 及2 倍体积无水乙醇颠倒混合沉淀DNA。室温下静止10-20 分钟，DNA 沉淀形成白色絮状物。
10. 用玻棒钩出DNA 沉淀,70%乙醇中漂洗后,在吸水纸上吸干,溶解于1ml TE 中,-20℃保存。
11. 如果DNA 溶液中有不溶解颗粒,可在5000rpm 短暂离心,取上清; 如要除去其中的RNA,可加5μl RNaseA(10μg/μl), 37℃保温30 分钟, 用酚抽提后, 按步骤9-10 重沉淀DNA。

第四节细菌基因组DNA 的制备
一、材料
　　细菌培养物。

二、设备
　　移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。

三、试剂
1、CTAB/NaCl 溶液：4.1g NaCl 溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。
2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶K (20mg/ml 或粉剂)，5mol/L NaCl。

四、操作步骤：
1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm 离心10 分钟, 去上清液。
2. 加9.5ml TE 悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg 干粉)蛋白酶K, 混匀,37℃保温1 小时。
3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。
4. 加1.5ml CTAB/NaCl 溶液, 混匀, 65℃保温20 分钟。
5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm 离心10 分钟, 将上清液移至干净离心管。
6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。
7. 加1 倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10 分钟，沉淀DNA。
8. 用玻棒捞出DNA 沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1ml TE, -20℃保存。如DNA 沉淀无法捞出,可5000rpm 离心, 使DNA 沉淀。
9. 如要除去其中的RNA, 可以按本章第三节中操作步骤处理。

第五节基因组DNA 的检测
　　上述方法得到的DNA 一般可以用作Southern, RFLP、PCR 等分析。由于所用材料的不同,得到的DNA 产量及质量均不同,有时DNA 中含有酚类和多糖类物质,会影响酶切和PCR 的效果。所以获得基因组DNA 后,均需检测DNA 的产量和质量。
1. DNA 溶液稀释20-30 倍后,测定OD260 /OD280 比值, 明确DNA 的含量和质量。
2. 取2-5μl 在0.7% agarose 胶上电泳, 检测DNA 的分子大小。
3. 取2μg DNA, 用10 单位(U)HindⅢ酶切过夜, 0.7% agarose 胶上电泳, 检测能否完全酶解(做RFLP, DNA 必须完全酶解)。如果DNA 中所含杂质多, 不能完全酶切, 或小分子DNA 多, 影响接续的分析和操作,可以用下列方法处理：
（1）选用幼嫩植物组织，可减少淀粉类的含量。
（2） 酚:氯仿抽提, 去除蛋白质和多糖。
（3）Sepharose 柱过滤, 去除酚类、多糖和小分子DNA。
（4）CsCl 梯度离心, 去除杂质, 分离大片段DNA(可用作文库构建)。

思考题:
1. 为什么构建DNA 文库时,一定要用大分子DNA？
2. 如何检测和保证DNA 的质量？

第七章RFLP 和RAPD 技术

第一节概述

　　DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP 是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA 水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA 的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA 片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD 技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA 多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR 技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10 聚体)为引物,对所研究基因组DNA 进行PCR 扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA 序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR 扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA 片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR 产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR 产物检测即可检出基因组DNA 的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD 可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。另外，RAPD 片段克隆后可作为RFLP 的分子标记进行作图分析。本实验将学习RFLP 的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD 技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。

第二节RFLP 技术

一、材料

　　 基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。

二、设备

　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。

三、试剂：

1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方见第九章。
6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。

四. 操作步骤
1. 基因组DNA 的酶解
(1) 大片断DNA 的提取详见基因组DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。
(2) 在50μl 反应体系中,进行酶切反应:
5μg 基因组DNA
5μl 10×酶切缓冲液
20 单位（U）限制酶(任意一种)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。
(4) 取5μl 反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb 的明显亮带出现。
[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。

2. Southern 转移
（1） 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V 过夜)后EB 染色观察。
（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl 中脱嘌呤, 10 分钟。
（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45 分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30 分钟。
（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC 中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC 盐溶液吸印,维持18-24 小时。也可用电转移或真空转移。
（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
（6） 将膜夹于2 层滤纸内, 80℃真空干燥2 小时。
（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂?

第七章RFLP 和RAPD 技术

第一节概述

　　DNA 分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。RFLP(Restriction Fragment LengthPolymorphism,限制片段长度多态性)已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。RFLP 是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，这种变化可以通过特定探针杂交进行检测，从而可比较不同品种（个体）的DNA 水平的差异（即多态性），多个探针的比较可以确立生物的进化和分类关系。所用的探针为来源于同种或不同种基因组DNA 的克隆，位于染色体的不同位点，从而可以作为一种分子标记(Mark)，构建分子图谱。当某个性状（基因）与某个（些）分子标记协同分离时，表明这个性状（基因）与分子标记连锁。分子标记与性状之间交换值的大小，即表示目标基因与分子标记之间的距离，从而可将基因定位于分子图谱上。分子标记克隆在质粒上，可以繁殖及保存。不同限制性内切酶切割基因组DNA 后，所切的片段类型不一样，因此，限制性内切酶与分子标记组成不同组合进行研究。常用的限制性内切酶一般是HindⅢ，BamHⅠ,EcoRⅠ,EcoRV,XbaⅠ,而分子标记则有几个甚至上千个。分子标记越多，则所构建的图谱就越饱和。构建饱和图谱是RFLP研究的主要目标之一。运用随机引物扩增寻找多态性DNA 片段可作为分子标记。这种方法即为RAPD(Random amplifiedpolymorphic DNA ，随机扩增的多态性DNA)。尽管RAPD 技术诞生的时间很短, 但由于其独特的检测DNA 多态性的方式以及快速、简便的特点,使这个技术已渗透于基因组研究的各个方面。该RAPD技术建立于PCR 技术基础上,它是利用一系列(通常数百个)不同的随机排列碱基顺序的寡聚核苷酸单链(通常为10 聚体)为引物,对所研究基因组DNA 进行PCR 扩增.聚丙烯酰胺或琼脂糖电泳分离,经EB染色或放射性自显影来检测扩增产物DNA片段的多态性,这些扩增产物DNA片段的多态性反映了基因组相应区域的DNA 多态性。RAPD 所用的一系列引物DNA 序列各不相同,但对于任一特异的引物,它同基因组DNA 序列有其特异的结合位点.这些特异的结合位点在基因组某些区域内的分布如符合PCR 扩增反应的条件,即引物在模板的两条链上有互补位置,且引物3'端相距在一定的长度范围之内,就可扩增出DNA 片段.因此如果基因组在这些区域发生DNA 片段插入、缺失或碱基突变就可能导致这些特定结合位点分布发生相应的变化,而使PCR 产物增加、缺少或发生分子量的改变。通过对PCR 产物检测即可检出基因组DNA 的多态性。分析时可用的引物数很大,虽然对每一个引物而言其检测基因组DNA多态性的区域是有限的,但是利用一系列引物则可以使检测区域几乎覆盖整个基因组。因此RAPD 可以对整个基因组DNA 进行多态性检测。另外，RAPD 片段克隆后可作为RFLP 的分子标记进行作图分析。

　　本实验将学习RFLP 的酶切,电泳和膜的制作以及RAPD 技术。探针标记及杂交检测方法请另详见分子杂交技术。

第二节RFLP 技术
一、材料
　　基因组DNA(大于50kb,分别来自不同的材料)。
二、设备
　　电泳仪及电泳槽， 照相用塑料盆5 只，玻璃或塑料板(比胶块略大) 4 块，吸水纸若干，尼龙膜(依胶大小而定)，滤纸，eppendorf 管(0.5ml)若干。
三、试剂：
1、限制性内切酶(BamHⅠ, EcoRⅠ, HindⅢ, XbaⅠ)及10×酶切缓冲液。
2、5×TBE 电泳缓冲液：配方见第一章。
3、变性液：0.5mol/L NaOH，1.5mol/L NaCl 。
4、中和液：1mol/LTris?Cl, pH7.5/1.5mol/L NaCl 。
5、10×SSC：配方见第九章。
6、其它试剂：0.4mol/L NaOH，0.2mol/L Tris?Cl, pH7.5/2×SSC ，ddH2O，Agarose 0.8%，0.25mol/L HCl 。
四. 操作步骤
1. 基因组DNA 的酶解
(1) 大片断DNA 的提取详见基因组DNA 提取实验,要求提取的DNA 分子量大于50kb, 没有降解。
(2) 在50μl 反应体系中,进行酶切反应:
5μg 基因组DNA
5μl 10×酶切缓冲液
20 单位（U）限制酶(任意一种)
加ddH2 O, 至50μl
(3) 轻微振荡, 离心,37℃反应过夜。
(4) 取5μl 反应液,0.8％琼脂糖电泳观察酶切是否彻底，这时不应有大于30kb 的明显亮带出现。
[注意] 未酶切的DNA 要防止发生降解, 酶切反应一定要彻底。
2. Southern 转移
（1） 酶解的DNA 经0.8％琼脂糖凝胶电泳(可18V 过夜)后EB 染色观察。
（2） 将凝胶块浸没于0.25mol/L HCl 中脱嘌呤, 10 分钟。
（3） 取出胶块, 蒸馏水漂洗, 转至变性液变性45 分钟。经蒸馏水漂洗后转至中和液中和30 分钟。
（4） 预先将尼龙膜,滤纸浸入水中,再浸入10×SSC 中,将一玻璃板架于盆中铺一层滤纸(桥)然后将胶块反转放置,盖上尼龙膜,上覆二层滤纸,再加盖吸水纸,压上半公斤重物, 以10×SSC 盐溶液吸印,维持18-24 小时。也可用电转移或真空转移。
（5） 取下尼龙膜, 0.4mol/L NaOH 30 秒, 迅速转至0.2mol/L Tris?Cl,pH7.5/2×SSC,溶液中, 5分钟。
（6） 将膜夹于2 层滤纸内, 80℃真空干燥2 小时。
（7） 探针的制备和杂交见第九章分子杂交部分。
[注意] 1、步骤（2）中脱嘌呤时间不能过长。
2、除步骤（1）、（4）、（5）外, 其余均在摇床上进行操作。
3、步骤（4）中,当尼龙膜覆于胶上时, 绝对防止胶与膜之间有气泡发生, 加盖滤时也不应有气泡发生。
4、有时用一种限制性内切酶不能发现RFLP 的差异，这时应该试用另一种酶。

第三节RAPD 技术
一、材料
　　不同来源的DNA(50ng/ul)。

二、设备
　　PCR 仪，PCR 管或硅化的0.5ml eppendorf 管，电泳装置。

三、试剂
1、随机引物(10mer) (5umol/L)：购买成品。
2、Taq 酶：购买成品。
3、10xPCR 缓冲液：配方见第八章。
4、MgCl2 ：25mmol/L。
5、dNTP：每种2.5mmol/L。

四、操作步骤：
1. 在25ul 反应体系中,加入
模板DNA 1ul (50ng)
随机引物1ul (约5pmol)
10xPCR Buffer 2.5ul
MgCl2 2ul
dNTP 2ul
Taq 酶1 单位（U）
加ddH2O 至25ul
混匀稍离心, 加一滴矿物油。

2. 在加热至90℃以上的PCR 仪中预变性94℃ 2 分钟, 然后循环: 94℃ 1 分钟， 36℃ 1 分钟，72℃ 1 分钟，共40 轮循环。
3. 循环结束后, 72℃ 10 分钟，4℃保存。
4. 取PCR 产物15ul 加3ul 上样缓冲液(6x)于2% 琼脂糖胶上电泳, 稳压50-100Ｖ（电压低带型整齐， 分辨率高）。
5. 电泳结束，观察、拍照。

[注意] 1、电泳时一般RAPD 带有5-15 条, 大小0.1-2.0kb。
2、特异性的DNA 带可以克隆作为一个新的分子标记应用。
思考题
1. DNA 酶切反应不彻底会有何结果? DNA 发生降解有何影响？
2. Southern 转移中脱嘌呤时间为何不能太长？
3. 随机引物扩增,为什么会产生DNA 双链产物?

第八章聚合酶链式反应(PCR)扩增和扩增产物克隆

第一节概述

　　PCR(Polymerase Chain Reaction,聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA 或RNA 的方法.它包括三个基本步骤: (1) 变性(Denature):目的双链DNA 片段在94℃下解链; (2) 退火(Anneal):两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对;(3) 延伸(Extension):在TaqDNA 聚合酶合成DNA 的最适温度下,以目的DNA 为模板进行合成.由这三个基本步骤组成一轮循环,理论上每一轮循环将使目的DNA 扩增一倍（图4）,这些经合成产生的DNA 又可作为下一轮循环的模板,所以经25-35 轮循环就可使DNA 扩增达106 倍。

一、PCR 反应中的主要成份
1. 引物：PCR 反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR 成败的关键。引物设计和选择目的DNA 序列区域时可遵循下列原则：(1) 引物长度约为16-30bp， 太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费,且难以合成。(2) 引物中G+C含量通常为40%-60%,可按下式粗略估计引物的解链温度Tm＝4(G+C)+2(A+T).(3) 四种碱基应随机分布，在3'端不存在连续3 个G 或C,因这样易导致错误引发。(4) 引物3'端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应, 以减少由于密码子摆动产生的不配对。(5) 在引物内, 尤其在3'端应不存在二级结构。两引物之间尤其在3'端不能互补, 以防出现引物二聚体, 减少产量。两引物间最好不存在4 个连续碱基的同源性或互补性。(7) 引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等. 通常应在5'端限制酶位点外再加1-2 个保护碱基。引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构, 以免产生非特异性扩增,影响产量。(9) 简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。一般PCR 反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm 光程比色杯中,260nm 下,引物浓度可按下式计算：
X mol/L＝ OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)
X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4 种不同碱基个数。

2. 4 种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP 应用NaOH 将pH 调至7.0,并用分光光度计测定其准确浓度.dNTP 原液可配成5-10mmol/L 并分装,-20℃贮存。一般反应中每种dNTP 的终浓度为20-200μmol/L。理论上4 种dNTP 各20μmol/L,足以在100μl 反应中合成2.6μg 的DNA。当dNTP 终浓度大于50mmol/L 时可抑制Taq DNA 聚合酶的活性.4 种dNTP 的浓度应该相等,以减少合成中由于某种dNTP 的不足出现的错误掺入。

3. Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA 聚合酶影响很大,它可影响酶的活性和真实性,影响引物退火和解链温度, 影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+ 浓度范围为0.5-2mmol/L.对于一种新的PCR 反应,可以用0.1-5mmol/L 的递增浓度的Mg2+ 进行预备实验,选出最适的Mg2+浓度。在PCR 反应混合物中, 应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团, 例如磷酸基团或EDTA 等可能影响Mg2+ 离子浓度的物质,以保证最适Mg2+ 浓度。

4. 模板：PCR 反应必须以DNA 为模板进行扩增, 模板DNA 可以是单链分子,也可以是双链分子,可以是线状分子,也可以是环状分子(线状分子比环状分子的扩增效果稍好).就模板DNA 而言,影响PCR 的主要因素是模板的数量和纯度.一般反应中的模板数量为102 -105 个拷贝,对于单拷贝基因,这需要0.1μg 的人基因组DNA,10ng 的酵母DNA,1ng 的大肠杆菌DNA.扩增多拷贝序列时,用量更少.灵敏的PCR 可从一个细胞,一根头发,一个孢子或一个精子提取的DNA 中分析目的序列.模板量过多则可能增加非特异性产物.DNA 中的杂质也会影响PCR 的效率。

5. Taq DNA 聚合酶：一般Taq DNA 聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130min,95℃ 40min, 97℃ 5min.现在人们又发现许多新的耐热的DNA聚合酶,这些酶的活性在高温下活性可维持更长时间.Taq DNA 聚合酶的酶活性单位定义为74℃下,30min,掺入10nmol/L dNTP 到核酸中所需的酶量.Taq DNA 聚合酶的一个致命弱点是它的出错率,一般PCR 中出错率为2×10-4 核苷酸/每轮循环,在利用PCR 克隆和进行序列分析时尤应注意.在100μl PCR 反应中,1.5-2 单位的Taq DNA 聚合酶就足以进行30 轮循环.所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减.酶量过多会使产物非特异性增加,过少则使产量降低.反应结束后,如果需要利用这些产物进行下一步实验,需要预先灭活Taq DNA 聚合酶, 灭活Taq DNA 聚合酶的方法有：(1) PCR 产物经酚:氯仿抽提,乙醇沉淀。(2) 加入10mmol/L 的EDTA螯合Mg2+ 。(3) 99-100℃加热10min.目前已有直接纯化PCR 产物的Kit 可用。

6. 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris?Cl (20℃下pH8.3-8.8), 50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+ . Tris?Cl 在20℃时pH 为8.3-8.8,但在实际PCR 反应中,pH 为6.8-7.8. 50mmol/L的KCl 有利于引物的退火.另外,反应液可加入5mmol/L 的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/ml 的牛血清白蛋白(BSA),它们可稳定酶活性,另外加入T4 噬菌体的基因32 蛋白则对扩增较长的DNA 片段有利.各种Taq DNA 聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

二、PCR 反应参数
1. 变性：在第一轮循环前,在94℃下变性5-10min 非常重要,它可使模板DNA 完全解链,然后加入Taq DNA 聚合酶(hot start),这样可减少聚合酶在低温下仍有活性从而延伸非特异性配对的引物与模板复合物所造成的错误。变性不完全,往往使PCR失败,因为未变性完全的DNA双链会很快复性,减少DNA产量.一般变性温度与时间为94℃ 1min。在变性温度下,双链DNA 解链只需几秒钟即可完全,所耗时间主要是为使反应体系完全达到适当的温度。对于富含GC 的序列,可适当提高变性温度.但变性温度过高或时间过长都会导致酶活性的损失。

2. 退火：引物退火的温度和所需时间的长短取决于引物的碱基组成，引物的长度、引物与模板的配对程度以及引物的浓度.实际使用的退火温度比扩增引物的Tm 值约低5℃。一般当引物中GC 含量高,长度长并与模板完全配对时, 应提高退火温度。退火温度越高, 所得产物的特异性越高。有些反应甚至可将退火与延伸两步合并,只用两种温度(例如用60℃和94℃)完成整个扩增循环, 既省时间又提高了特异性。退火一般仅需数秒钟即可完成,反应中所需时间主要是为使整个反应体系达到合适的温度。通常退火温度和时间为37℃-55℃,1-2min。

3. 延伸：延伸反应通常为72℃,接近于Taq DNA 聚合酶的最适反应温度75℃.实际上,引物延伸在退火时即已开始,因为Taq DNA 聚合酶的作用温度范围可从20℃-85℃.延伸反应时间的长短取决于目的序列的长度和浓度.在一般反应体系中,Taq DNA 聚合酶每分钟约可合成2kb 长的DNA。延伸时间过长会导致产物非特异性增加.但对很低浓度的目的序列, 则可适当增加延伸反应的时间。一般在扩增反应完成后,都需要一步较长时间(10-30min)的延伸反应,以获得尽可能完整的产物, 这对以后进行克隆或测序反应尤为重要。

4. 循环次数： 当其它参数确定之后, 循环次数主要取决于DNA 浓度。一般而言25-30 轮循环已经足够。循环次数过多,会使PCR 产物中非特异性产物大量增加。通常经25-30 轮循环扩增后, 反应中Taq DNA 聚合酶已经不足, 如果此时产物量仍不够, 需要进一步扩增, 可将扩增的DNA 样品稀释103-105 倍作为模板, 重新加入各种反应底物进行扩增, 这样经60 轮循环后, 扩增水平可达109-1010 。扩增产物的量还与扩增效率有关,扩增产物的量可用下列公式表示:C＝C0 (1+P)n 。其中：C 为扩增产物量,C0 为起始DNA 量, P 为增效率, n 为循环次数。在扩增后期,由于产物积累,使原来呈指数扩增的反应变成平坦的曲线,产物不再随循环数而明显上升,这称为平台效应。平台期会使原先由于错配而产生的低浓度非特异性产物继续大量扩增，达到较高水平。因此，应适当调节循环次数，在平台期前结束反应， 减少非特异性产物。