样品前处理技术
如何对越来越复杂的样品基质进行痕量分析及其样品前处理已成为业界的一大挑战。为了满足全球日益增长的人口需要，食物产量需要很大的提升，这也导致了多种农药的使用。但农药的施放有时并非完全合理，有时农产品本身不需要，也会被施放，所以检测工作者必须不断改善检测技术，对越来越多的农药进行痕量检测。而此时多类农药残留的分析方法就得到了高度的关注，特别是在食物供应频频出现安全事件的阶段。
传统的样品处理技术经历了液固萃取、液液萃取、固相萃取几个阶段。随着高灵敏、选择性的LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS的快速发展，美国农业部的Steven J. Lehotay 博士和德国的化学家Michelangelo Anastassiade共同研发了一种用于蔬菜、水果中痕量农药残留分析的新方法，即QuEChERS（quick、easy、cheap、effective、rugged and safe）。将水溶液中的固体样品加盐后经过乙腈萃取，然后通过液固萃取（基质分散固相萃取，dispersive-SPE）去除乙腈中存在的大部分干扰物，最后通过一种或多种检测技术进行分析。通过与LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS的结合使用，QuEChERS得到了长足的发展，成为了全球检测水果、蔬菜中农残时的标准样品处理方法。除此以外，其应用也涉及到越来越多的不同领域，比如肉类、血液样品、酒、甚至土壤中抗生素、药物、滥用药、还有其他污染物的检测。
方法的主要改进
Ron Majors：QuEChERS最早在2003年面世，从开发到现在，你们对该方法做了哪些改进？
Lehotay：在QuEChERS的构思阶段，我们对大范围的代表性农药、样品进行了多次的实验，对每次提取、净化步骤进行评估。2003年的QuEChERS版本对于被测物及其基质来说是不错的，当我们在对不同样品中上百种农药进行方法验证时，发现大概有10种农药的回收很容易受pH的影响，而使用pH＝5的缓冲液是不错的解决方法，因此在之后的方法中我们也开始注意缓冲液的使用。这是方法的第一个改进，但不足之处在于缓冲液的使用也会导致一些杂质的增多。
其次， C18填料与PSA一起添加能明显地改善某些样品的净化效果，特别是那些富含油脂的样品，比如橄榄油，而且不会造成被测物的损失。有些化学家采取冷冻的方法去降低脂类的干扰，这同时也能除去一些之前萃取中带入的杂质，但是相比之下，C18无疑更快、更容易，而且去脂效果与冷冻法相当。目前，欧盟标准方法EN 15662已经收录了添加C18的方法，但遗憾的是，AOAC官方方法2007.01中尚没有提及这个方法。另外，有时遇到含有较多油脂的谷物时，可以提高d SPE中PSA的用量。
最后，叶绿素、类胡萝卜素这类杂质的去除可以如CEN 标准方法156627所述，加入少量石墨化碳黑或者加入美国UCT公司的ChloroFiltr吸附剂，但缺点是会对某些平面结构的农药造成25％左右的损失。
方法开发中的难题
Ron Majors：在开发QuEChERS方法时遇到的几个最大的困难是什么？
Anastassiades：我们并不认为在开发这个方法时遇到过什么大的挫折。QuEChERS自从在第四届欧洲农残专题讨论会公布后反响巨大并从此得到快速发展。我们把QuEChERS方法与欧洲沿用了15~20年的方法进行比较，发现前者能节省95％的溶剂（10ml Vs 535ml），95％的耗材成本，还有90％的时间。查看欧洲每年对水果、蔬菜进行的农药检测报告，就会发现在2009年130~150个参加比对的实验室中近40％是使用QuEChERS方法的。私人实验室由于更加考虑成本，QuEChERS的采用率更高至近70％。
图1. 与近年发展快速的LC-MS、GC-MS以及LC-MS/MS结合使用，QuEChERS也得到了长足的发展。
QuEChERS方法使用中的最大困难恰恰来自于其优势：灵活性。对于上百种样品、上百种农药而言，即使对方法进行一些调整也能得到较高的回收率。有人曾经说过“分析方法就像是牙刷，每个人都情愿只用自己的一个”。比如，我想用柠檬酸缓冲液（相对低的缓冲容量），Lehotay却想用醋酸缓冲液（较高浓度，拥有更大的缓冲容量）。我们都有各自的理由，但最后两个方法也都被许多实验室在不同的食物上进行了充分的验证。
检测中方法的调整是必须的，但是现在许多时候，它给人的印象只是仅仅为了标新立异地写一篇文章，一篇报告，而这些调整往往使方法变得更加耗时、更易受影响、花费更大。
灵活性带来的另外一个问题是，QuEChERS方法能适应不同的样品大小、不同的进样体积、不同的溶剂。因此，供应商根据全球不同实验室的要求设计了众多不同的产品，可供选择的规格过多导致分析时容易产生混乱。
或许所有多种类农残分析方法中最大的困难就是对于某种农药（比如克菌丹，敌菌丹，灭菌丹和百菌清）不能得到高的、持续稳定的回收率。酸性环境能减少这类农残的损失，但是这些被测物却容易在非酸性的样品中发生降解，甚至样品还没萃取时就会出现这样的现象。不幸的是，这类化学物不适用于液质分析，气质分析也存在问题。在气质分析时，必须严格控制好相关条件才能得到高质量的检测结果，而这在日常检测中是不大可能的。因此，QuEChERS被一些人批评还不够完美。在一些原创的QuEChERS论文中，通过使用被测物保护剂（APs），可以减少这类麻烦出现。
适用范围不断扩大
Ron Majors：虽然QuEChERS刚开始时是针对水果、蔬菜中多农残提取的一个方法，但是现在它已被应用在越来越多领域如兽药，多环芳烃PAHs与抗生素等，检测越来越多的不同样品，如血浆、肉、土壤等。这些方法也许并没有像你们以前那样小心地做过室间测试和评估，你们如何看待这种现象？
Lehotay：我们很开心QuEChERS能被扩展使用于不同的领域。方法在工作中的使用效果，要具体问题具体分析，这取决于是否有科学依据，而与QuEChERS自身无关。但在所有新开发的方法中，大家必须要注意评估其效果以及有效性。
从一开始，我们并没有对QuEChERS进行ZL控制，首先，我们觉得化学方法或基质萃取是不能进行ZL控制的（毕竟，在使用毛细管前Tswett已用吸附剂进行色谱分离），其次，我们都认为，如果不对此插手，QuEChERS方法可以应用到更多的领域。我们的团队都没有从QuEChERS的商品化中得到利益。
为了“保护”QuEChERS，我们所做的就是对国际官方方法的验证以及认证机构（AOAC和CEN）进行支持。AOAC方法2007.01与CEN标准方法EN15622都是经过验证的方法，其调整后的版本只要经过充分的验证，都是可以接受的。
但我们也注意到，在方法的开发以及次数有限的验证试验中，加标样品虽然均能得到良好、稳定的回收率，但是，现实中某些基质与分析物之间具有强烈的作用，常规分析中也会出现一些仪器维护问题，这些都可能导致无法得到好的回收率。比如，QuEChERS在土壤分析中的应用，因为这需要用到更强的提取环境——加压萃取（PLE）或者索氏提取而不是手摇式萃取，以克服土壤－沉淀物之间的强烈吸附力。而许多食品中并不会有这么强的作用力，所以手摇式萃取已可获得令人满意的回收率。
图2. 2003版方法、AOAC官方方法2007.01、CEN标准方法 EN 15662。
Ron Majors：QuEChERS最初是为痕量农残分析而开发的，使用这一技术以从事农药残留检测的实验室为主，这类实验室都非常熟悉代表性样品的采集以及数据统计。而现在QuEChERS已被许多非农药实验室用于各种各样的痕量分析，这类实验室往往缺乏像农残分析师那样的经验丰富的专业人士，你们认为QuEChERS方法是否会因为样品采集不具代表性而出现不理想的结果？
Anastassiades：其实不仅是QuEChERS，使用所有检测方法时我们都要考虑该方法对样品的要求。我们在论文、报告中一再强调样品的采集以及均质化是QuEChERS步骤中非常重要的环节，这样也有利于得到更小的样品颗粒，对于之后的摇动萃取也有帮助。甚至可以夸张地说，用于粉碎样品的市值5000美元的粉碎机，其重要程度并不低于价值300000美元的液质联用仪。
QuEChERS的自动化
Ron Majors：QuEChERS仍然主要是由人工操作，比如手摇萃取和样品操作等。你们如何看待该技术的自动化？
Lehotay：当前QuEChERS面临的问题不是使其更快、更简单，而是使其更便捷，而自动化往往会使样品处理花费更多的时间与精力和费用。一个化学工程师手工处理一批样品往往会比一个普通人在自动处理机上上样、卸样要快。幸运的是，当每次只需震摇管子1min时，每个人足以同时应付6~10个提取用的离心管（50ml）。
当然，实验室的化学工程师们最容易抱怨的问题之一还是他们不太喜欢震摇这个步骤（尽管我们建议可以想像边听音乐边做QuEChERS之舞），另外，不同操作人员的震摇力度也不相同。所以，在QuEChERS的萃取过程中能有一台强力的震摇机的确会是一个很好的办法，特别是对于一些有能力的实验室来说。Anastassiades目前正在研究对食品类样品进行农残萃取时环境的影响因素。在大部分情况下，1min的萃取时间已经足够，当然在某些情况下，增大萃取时间还是会显著提高萃取效率。以一些农残已扩散到蜡质层结构的样品为例，蜡质的颗粒样品明显需要更长的萃取时间，而自动化的震摇装置这时就显得很有必要了。
然而，基质萃取这个步骤就无需这种强度的萃取，只要30 s的震摇即可，因此这也不必自动化。半自动的DPX装置能同时处理20个样品，其处理量基本与手动操作相当。如果在此用到自动化装置虽然理论上会减少时间，但是会增加维护成本、仪器停机时间。
残留化学物分析现在还并不需要像诊断或药物分析那样一次处理如此多的样品，但是如果QuEChERS用于大批量的样品处理，这时自动化就显得十分重要了。Gerstel公司正在与DPX等实验室合作，实现QuEChERS的自动化操作。
基质干扰
Ron Majors：萃取过程往往容易受到基质干扰，如何克服QuEChERS方法中的基质干扰？
Anastassiades：食品类样品大部分不会出现基质干扰（某些干燥的、有油脂的样品例外）。但也有些复杂样品（比如茶叶、中药、香料、肝脏、柑桔油等）无论使用什么方法都会存在基质对农残的吸附。因为如果基质中含有与被测物结构相似的杂质时，很难通过样品预处理过程除去。而通过一些诸如调节萃取剂、调节pH、加盐、改变体积比、加水、吸附剂等手段或许可以起到一定作用。
关于pH的影响，我们发现要从蘑菇中定量提取尼古丁时，需要调节pH至10~11。而从洋葱、韭菜中提取百菌清时，pH就要调至2，这样才能降低基质对其的吸附提高回收率，另外对于沙蚕毒素类的农药，低pH值也是必须的。
酸性的除草剂易于形成共价键结合的残留。这类农药是常见的允许合法使用的农药，因此必须在液液提取前将其释放出来。通常我们可以通过先调节pH到12碱解30min，然后再调回中性进行QuEChERS萃取。
还有一种情况，某类农药采用针对性强的前处理方法能达到很好的回收，但却会降低另外一些农药的回收，在多种类农药提取时这情况很难难免。
当遇到上述这些复杂的情况时，我们就要依靠色谱-质谱联用分析法来完成。高灵敏度的仪器可以使最终提取液具有更低的样品浓度（比如某些例子里的0.1g/ml），高选择性的色谱-质谱仪更能使我们忽略与目标物同时出峰的杂质。当重现性与检出限有冲突时，凝胶色谱或者分馏提取液会是一个好的解决方法。但是这时也要考虑检测结果需要满足何种要求，比如实验的时间、成本、劳动力以及仪器设备等各种因素。
配套检测器
Ron Majors：QuEChERS提取液是比较脏的，如何选择合适的检测器？
Lehotay：传统的通用检测器FID与UV-DAD并不适应于所有的农残分析。我们必须用一些高选择性的检测方法进行补充，比如气相中的FPD、PFPD、NPD、ELCD、ECD、XSD检测器、液相中的柱后衍生等等。在LC/MS/MS出现前，较大范围的极性农残是不在监控目录之中的，这是因为单一的分析方法在实践操作中显得太触襟见肘了。之前的多农残分析方法多是为气相分析设计的，而QuEChERS联合LC/MS/MS就大大提高了农残监控的能力。
在LC/MS/MS或者GC/MS/MS的帮助下，我们在典型样品的分析中很少会遇到杂质干扰等情况（除了某些香料和柑橘类植物）。同样，QuEChERS结合气相、液相中的选择性检测器对比之前的方法也并不能在减少杂质干扰上进行大幅的改善。如前所述，QuEChERS只是能在某些分析方法上被采纳用以调整提取和提纯。
当今GC/MS特别是LC/MS/MS，被认为在对农残的分析中是必不可少的。许多正被逐渐注意到其毒性并加以销售监管的农药只能通过LC-MS进行检测。我们也建议那些正为发展中国家建立出口管制实验室提供技术、金钱支持的团体，与其帮其投资LC-DAD、GC-NPD或者GC-ECD这些设备，不如直接帮助其一步升级到LC/MS/MS。这样做投资虽然巨大，但是值得。因为这可以检测到大部分，特别是最重要的那些农药残留，大大提高出口产品获得认可的能力，减少产品被拒入境的困境。
SPE小柱与d SPE
Ron Majors：虽然分散基质萃取是QuEChERS中最普通的步骤，我注意到亚洲有些检测人员，仍然选择类似SPE小柱的装置比如双层填料的小柱（如 GCB/PSA）进行净化操作，这是一种“化学过滤”。你们是怎样看待SPE小柱与分散基质固相萃取的差别？
Lehotay：是的，SPE小柱的确会比分散基质固相萃取更能有效去除杂质，但是它会降低某些极性农残的回收，同时也需要更多的时间以及金钱。我们在考虑用分散基质固相萃取前，也曾经想过用SPE小柱这类化学过滤的方法，但是无水硫酸镁可能会堵塞筛板。在分散基质萃取中必须要用吸水剂把有机层中的水分从7％降到2％（这有助于PSA的净化以及减少进入GC系统中的水分）。当使用氯化钙代替硫酸镁时会达到更低的水分残留以及更好的净化效果。该方案已成功用于发酵茶提取物的净化，但也有不利之处，对于最高极性的农药甲胺磷，会有大概20％的回收损失。我们也试过用SPE小柱或滤膜，但是最后还是觉得分散基质固相萃取效果较好。DPX也是一个选择，它能过滤含有大于2 um颗粒杂质的提取液。
传统的SPE经常被用来进行QuEChERS中的净化，但是我们发现与其相比，在农残的检测上，分散基质萃取能提供更高的回收率，而且操作更快，更简单也更便宜。许多检测的同行认为SPE是净化的首选，但是使用传统的SPE，其实也意味着使用真空箱，真空泵，繁多的预处理步骤（活化，上样，淋洗，洗脱），收集管，流量控制，溶剂挥发，小心的操作，还有检验人员需要的费力的方法开发。
d SPE的固定相
Ron Majors：请预计一下分散基质萃取固定相的增长需求？如果能设计所谓的 “完美”吸附剂，你们觉得应该要满足什么要求？
Anastassiades：分散基质固相萃取中用到的许多固定相都是来自SPE。对于所谓的完美吸附剂应该能只除去最终提取液中的杂质而不损目标物。在所有的食品中，这些杂质包括脂肪，碳水化合物，蛋白质，水和少量的金属成份，维生素与因个体而异带来的各种天然产物。QuEChERS方法中的选择性提取步骤会除去部分杂质（脂肪，水，蛋白质，糖分）。分散基质萃取步骤的设计就是为了进一步降低残存杂质的，因为这些杂质会影响分析从而导致基质效应，减少回收，降低设备重现性，比如脂肪和其他酸性物质，叶绿素，花青素等其他色素，甾醇类化合物，水。
每毫升提取物加入150mg硫酸镁，50~150mg PSA，50 mgC18，7.5mg GCB进行萃取是我们所知的对于食品中农残分析的最好分散基质固相萃取方案，它能在很广的浓度范围内提供高的回收率。采用其他吸附剂，改变其用量，调整pH或溶剂组成，正已烷去脂，这些步骤可能会使得杂质去除得更好，但是会降低农残的回收。分子印记技术（MIPs）能针对性地去除某类杂质成份，在不降低被测物回收的前提下，这是一个很好的补充。
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