汽化过氧化氢对外来动物病毒的消毒功效评估

摘要

本文进行了在传递舱内使用汽化过氧化氢对设备与物体表面（受外来动物病毒潜在污染的）消毒功效评估。实验对不同的病毒剂进行了研究，包括从禽类与哺乳类动物感染的几个具有代表性病毒科家族（Orthomyxoviridae正粘病毒科、Reoviridae呼肠病毒科、Flaviviridae黄病毒科、Paramyxoviridae副黏液病毒科、Herpesviridae疱疹病毒科、Picornaviridae微小核糖核酸病毒科、Caliciviridae杯状病毒科与Rhabdoviridae弹状病毒科），并特别着重于对加拿大的外来动物病毒进行研究。汽化过氧化氢对不同实验室设备的熏蒸影响同时也是本实验研究目的。细胞培养基、蛋清或血液里的病毒悬浮液被干燥到玻璃器与不锈钢器皿中，然后暴露于汽化过氧化氢30分钟，再评估病毒的存活率。在所有条件下的所有测试病毒中，灭菌过程使鸟类病毒（禽流感与新城鸡瘟病毒）效价减少至0ELD₅₀，使哺乳类病毒（African swine fever非洲猪瘟疫、bluetongue蓝舌病、hog cholera猪霍乱、pseudorabies狂犬病恐怖症、swine vesicular disease猪水泡病、vesicular exanthema猪转染性水疱病、vesicular stomatitis viruses水泡性口炎病毒）减少至低于1 TCID₅₀。实验室设备同时暴露于过氧化氢气体中，没有受到任何损害。对处理外来动物病毒剂的生物安全实验室III来说，汽化过氧化氢可以做为一种安全有效的消毒方式用于消除潜在的病毒污染物。

材料与方法

设备:过氧化氢发生器一台，机器通过1.5英寸的聚乙烯导管连接到18立方英尺大小的不锈钢传递舱。传递舱内内置了两个循环风扇以确保汽化过氧化氢的均匀分布。在灭菌的每个阶段都对舱体进行压力监控，在舱体内的三个不同位置放置温度监测探头进行温度监控。传递舱加压至2.0 in.水柱压力，通过18小时的衰减，计算衰减率是否超过0.08in./h。

循环参数：生物灭菌系统按程序设定进行运作。以30%浓度的过氧化氢水溶液为试剂，在10cfm的气流速率下，过氧化氢的注射率为2g/min，喷射时间30分钟，以大约1.73mg/l或1211ppm的稳定状态维持。接下来在气流速率为10cfm的状态下，通风阶段的时间为3.5小时。在所有的循环阶段，舱体内一直维持着相当于2.0至3.0英寸水柱的负压。

生物指示剂：使用嗜热脂肪芽胞杆菌在传递舱内布点，当循环结束后，打开传递舱收集指示剂，放入胰蛋白胨大豆肉汤培养基，在56℃条件下培养7天。培养基的浑浊度是细菌生长的标志。如果灭菌过程杀灭了3.4*10⁵个孢子，则认为灭菌过程成功。

同时研究使用了来自八种不同病毒家族的八种不同病毒（表1）。所有的病毒都按标准方法进行操作。病毒接种在以下三种介质的其中一种: i.带有5%胎儿牛血清的最小必要培养基（细胞内繁殖病毒所需的标准生长介质）；ii.尿囊液（鸡蛋内繁殖的病毒）；iii.猪血（动物血液里繁殖的病毒）。经过汽化过氧化氢灭活后，可在两种条件下评估病毒：使病毒悬浮在液体中或使干燥在固体支持物上。

材料兼容性测试：为了确保汽化过氧化氢成功地被定义为一种无破坏性的杀菌剂，实验中置放了几种不同类型的设施做暴露熏蒸，然后评估其损害情况。这些设施包括电话机、摄像头、未使用的胶卷、X射线胶片、拍摄好的宝丽来照片、计算机硬盘（运行五个程序）、手提电脑（运行五个程序）、电钻、手表、电子计时器、电动吸液器。

结果  

在循环结束后对收集的生物指示剂进行培养显示所有的孢子都失活，培养基里没有任何孢子生长，证明了灭菌循环是成功的。

表2显示了灭菌过程对不同病毒效价的影响。除了悬浮在血液中的猪霍乱病毒，灭菌过程将禽流感病毒的病毒效价从8.5 或9.6半数胚胎致死量（ELD₅₀）减少至0 ELD₅₀，同时将哺乳类病毒从6.5~9.0半数组织培养感染量（TCID₅₀）减少至低于1 TCID₅₀。不管病毒是在液体条件或干燥条件，这份观察结果都不会变。对于猪水疱疹病毒，单加热就可以减少可提取病毒量的几个log单位。对于细胞培养的疱疹病毒、猪霍乱病毒及水泡性口炎病毒，单干燥就可以使可提取病毒量低于1 TCID₅₀。只有血液里的禽流感病毒、猪霍乱病毒以及尿囊液里的新城鸡瘟病毒、伪狂犬病病毒、水泡性口炎病毒在干燥并经传递舱加热后仍保持大于1个对数单位的效价（未经汽化过氧化氢熏蒸）（表2）。大多数情况下，从玻璃制品提取的病毒滴量与从钢化制品提取的病毒滴量并没有明显的差异。不管是细胞培养液或是尿囊液里的病毒，经过汽化过氧化氢熏蒸后，被杀灭率几乎都一样，如表2显示的水泡性口炎病毒。

讨论  

本研究结果显示了高浓度汽化过氧化氢可以安全地存在密闭空间中。此次灭菌过程的过氧化氢浓度显示能将禽类病毒的病毒效价减少至0 ELD₅₀，将哺乳类病毒的病毒效价减少至1 TCID₅₀。之前的研究已经表明嗜热脂肪芽胞杆菌是最有抵抗性的，所以汽化过氧化氢能杀灭生物指示剂，那么对抵抗力没那么强的微生物比如病毒来说应该是完全有效的。这与学者Klapes的研究结果是一致的，他发现了致病性细菌、酵母、真菌孢子、病毒与细菌孢子能迅速被失活（3）。唯一的例外情况是病毒在血液中时发现不同的结果。虽然5%的牛犊血清或蛋清同样也富含有蛋白质，但可能的解释还是血液是一种富含蛋白质的物质，在某种程度上能保护病毒不受气体的氧化性质影响。同时也有可能是由于细胞自然含有过氧化物酶与过氧化氢酶，红细胞的这些内源性酶可以中和一定的过氧化氢或所有的过氧化氢，使灭菌过程无效。世界上各地的生物安全实验室III或IV传统上都是用甲醛在处理外来病毒，本篇研究显示了汽化过氧化氢能很好地取代甲醛。汽化过氧化氢在熏蒸过程中非常有效地杀灭病毒，同时不破坏任何实验室设备，这使它能做为生物安全实验室III或IV的最佳消毒选择。

参考文献：

[1]Block, S. S. 1991. Peroxygen compounds, p. 167–181. In S. S. Block (ed.),Disinfection, sterilization and preservation, 4th ed. Lea and Febiger, Philadelphia, Pa.

[2]Johnson, J. W., J. F. Arnold, S. F. Nail, and E. Renzi. 1992. Vaporized hydrogen peroxide sterilization of freeze dryers. J. Parenter. Sci. Technol.46:215–225.

[3] Klapes, N. A. 1990. New applications of chemical germicides: hydrogen peroxide, abstr. 20, p. 14–15. In Program and abstracts of the ASM International Symposium on Chemical Germicides. American Society for Microbiology,
Washington, D.C.

etc.