TEM-105编码基因的克隆与原核表达
由于一种细菌可同时产生多种β内酰胺酶，因此为了避免多种β内酰胺酶的相互干扰，我们应用肉汤稀释法对产超广谱β内酰胺酶（ ESBLs ）的 4 株肺炎克雷伯菌（ Kpn ）的 TEM 型编码基因进行了原核表达。
一、 材料和方法
1． 菌株来源和表型鉴定： 4 株临床菌株 No95 、 No96 、 No102 、 No106 为浙江省台州第一医院内科患者痰标本分离的 Kpn 。经抑制剂增强的肉汤稀释法证实为阳性。
2． 细菌质粒 DNA 提取与 PCR 扩增：采用碱裂解法提取质粒 DNA 。根据 TEM-1D 编码基因序列设计的 TEM 引物序列为 5' -TTAGACGTCAGGTGGCACTT -3' （ 76 ～ 95 ）和 5' -GGACCGGAGTTACCAATGCT -3' （ 1065 ～ 1084 ），由上海生物工程公司合成。 PCR 反应参数同前。设大肠埃希菌？（ Eco ） ATCC25922 、标准产酶 Eco （ TEM-26 ）作对照。
3． PCR 产物的纯化、克隆：按照 PCR 产物纯化 kit （ QIAgen ）的要求，纯化目的片断，取 3μl 与 pGEM-Teasy Vector(Promega) 连接。连接反应液转化至 EcoDH 5a 感受态细胞，经含氨苄西林（ Amp50μg/ml ）的麦康凯培养基筛选。挑取白色菌落，接种于含 Amp 的 LB 培养液中， 37 ℃ 培养过夜。经 EcoRI （ Takara ）酶切鉴定。
4． 核苷酸序列测定及分析：以重组菌双链质粒为模板，按 Sanger 双脱氧末端终止法，于 Pharmacia 公司 ALF 自动测序仪进行双链测序，结果在 GenBank 网上查询。
5． 接合试验：按照 Jacoby 等的方法进行，其中 EcoC600 （ Str r ，即链霉素抗性）为质粒接和试验的受体菌。
6． 原核表达：分别加入 pET -28c 3 μl 、目的 DNA 3 μl 、 2 × Buffer5μl 和 T4 连接酶 2μl 于 0.5ml 的 Eppendorf 管中， 37 ℃ ，过夜。上述连接产物转化于 EcoDH 5a 感受态细胞中，用的含卡那霉素 40μg/ml 的麦康凯培养基平板进行筛选。
7． 表达鉴定：挑取白色菌落置于含 Amp 的 LB （ 50μg/ml ）液中， 37 ℃ 振荡过夜培养。碱裂解法提取质粒，并用 PCR 进行表达鉴定。
8． 表型鉴定：用 ESBLs 浓度梯度法进行表型鉴定。
9． 等电点（ pI ）测定：超声破碎获得酶的粗提液。按照 PhastSystem 电泳仪说明书和 Pharmacia Biotech 凝胶要求进行，电泳后，用头孢硝噻吩染色，标准蛋白用考马斯亮蓝 R-250 染色，用 CurveExpert1.3 软件计算 pIs 。
二、 结果
1． 接和试验： 4 株临床菌株结果均为阳性，其相应接合子分别为 C95 、 C96 、 C102 和 C106 。碱裂解法提取质粒，并用 TEM 引物进行 PCR 扩增，结果显示：临床菌株和相应接合子的质粒在 1009bp 处均可见到一电泳条带，与标准菌株（ TEM-26 ）的扩增片段大小一致，而 C600PCR 扩增结果为阴性。表明这种 TEM 型 β内酰胺酶的基因位于质粒上。
2． 基因型鉴定：用 TEM 引物对 4 株临床菌株进行 PCR 扩增，其结果均为阳性，其片段大小近 1009bp ，与标准菌株（ TEM-26 ）的扩增片段大小一致，而空白对照和 EcoATCC25922 的结果为阴性。这些片段经序列分析，结果显示： 4 株细菌的序列均为 1009bp ，与广谱酶 TEM-1 相比较，其序列有 6 个位点的改变，即第 124 位、第 8 位、第 48 位、第 134 位、第 160 位和第 242 位（ gga → ggg ），相应的氨基酸只有第 124 位的丝氨酸变为天冬酰胺。我们首次登录 GenBank ，并被命名为 TEM-105 。
3． TEM-105 的特性研究：用 ESBLs 浓度梯度法进行鉴定，标准产 TEM-26 菌株的原核表达菌为阳性，而 4 株临床菌株的 TEM 型基因的原核表达菌均为阴性，表明 TEM-105 为非 ESBLs 。等电聚焦电泳结果显示该酶的 pI 为 5.4 。
三、 讨论
本研究的，标准菌株（ TEM-26 ）经 TEM PCR 扩增后的目的片段，与 pET -28c 连接后，可成功地在 EcoDH 5a 感受态细胞中表达，这表明原核表达用于某种 β内酰胺酶的研究是可靠的。此外，质粒接合试验证实了其耐药基因位于质粒上。这表明，尽管由于点突变未引起β内酰胺酶活性部分的空间构象改变，所以未引起酶性质的改变。
通过对 KpnTEM 型 编码基因的研究，在世界上首次报道了 TEM-105 ，并证明其为广谱酶性质。
