维生素E对4℃贮存红细胞保护作用的实验研究
本课题为山东省科委资助项目(No.961226817) 血液在4℃贮存期间，随着时间的延长，红细胞腺苷三磷酸(ATP)含量降低，微囊形成和磷脂丢失，致使红细胞的活力降低，红细胞膜结构和功能发生改变，输血后红细胞存活率降低［1］。这些变化与氧化物质对红细胞的氧化损伤有关［2］。笔者在枸橼酸-枸橼酸钠-葡萄糖(ACD)溶液保存的血液中加入维生素E，观察其抗氧化作用对4℃贮存红细胞的影响，为应用于血液贮存提供依据。 1 材料和方法
1.1 仪器 FG－300型发光光度计(中科院上海植物生理研究所)；721型分光光度计(上海分析仪器三厂)。
1.2 试剂 ATP生物发光测定试剂盒(中科院上海植物生理研究所)；邻甲苯胺(分析纯，上海试剂三厂)；超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒(南京建成生物科技研究所)。
1.3 ACD－B血袋(威海市高分子材料厂)。内含50mlACD溶液。
1.4 维生素E乳剂制备 参考苗林［3］的维生素E静脉乳剂制备方法经改进。取注射用维生素E经过研磨，12000r/min高速搅拌、GB滤器过滤和流通蒸气灭菌等步骤制成粒径在1μm左右，维生素E含量为2g/L的乳剂。
1.5 血样本 全血采自10名健康献血者，平均年龄28岁，每名采血200ml。
1.6 血样本的保存与处理 以血库技术标准每名献血者采血200ml于含50mlACD溶液的采血袋中，并立即以10ml分别分装于24只无菌的PVC塑料小袋中，取12只分装的血样品，平均分配为维生素E组和对照组，采自10名献血者的血液均作同样处理，分装后剩余的样品用作其它实验。用微量加样器将维生素E组每10ml血液中加入维生素E(2g/L)乳剂20μl，使ACD血液中的维生素E终浓度为40mg/L。然后各组血液均置于(4±2)℃冰箱内保存35d。分别在采血当天，贮存的第7、14、21、28、35天测定各组来自于10个献血者血液样品的红细胞超氧化物歧化酶(SOD)活力、红细胞ATP和血浆游离血红蛋白浓度。
1.7 红细胞ATP测定 参照文献［4］的方法，提取含ATP的上清液为U，按ATP试剂盒说明书的方法配制好ATP标准液和发光素酶系统。取U 0.2ml或不同浓度的ATP标准液0.2ml加至发光反应杯内并置于发光光度计反应暗室中，通过连通管路准确注入0.8ml荧光素酶液，并记录发光强度。以gHb表示，将标准品和U样品所得发光值进行计算得出ATP浓度(μmol/gHb)。
1.8 血浆游离血红蛋白测定［5］ 取ACD全血离心，取上层血浆0.02ml和血红蛋白标准应用液0.02ml，依次加入2%邻甲苯胺溶液及1%H2O2溶液各1.0ml。放置10min，分别加入10%乙酸溶液10ml混合，在435nm进行比色，计算得出血浆游离血红蛋白含量(mg/L)。
1.9 红细胞SOD测定 黄嘌呤氧化酶法(按试剂盒说明书的步骤进行检测)。
1.10 统计学处理 所得数据以平均数±标准差(±s)表示，组间均值差异比较用t检验。
2 结果
血液在4℃贮存的35d期间，红细胞ATP浓度，血浆游离血红蛋白浓度和红细胞SOD活力的变化情况以及维生素E组与对照组比较结果，见附表。
3 讨论
ATP是红细胞内能量物质，红细胞ATP浓度可以作为判断红细胞活性的指标之一，当其ATP浓度低于1.5μmol/gHb时，红细胞存活率就会下降［6］。血液保存期间，由于红细胞膜受到损伤，血红蛋白从红细胞内逸出，因此血浆游离血红蛋白是指示红细胞膜损伤及溶血的重要指标。SOD可催化超氧化物自由基发生歧化反应，防御自由基对细胞的氧化损伤，通过SOD活力的变化可以了解其抗氧化作用的状态。Wofe等［7］认为红细胞的完整性是输入红细胞存活的决定因素，而红细胞在血液贮存过程中，必然会发生膜的氧化损伤。维生素E是人体内重要的抗氧化物质，由于其极易被氧化，从而能防御自由基等氧化物质对红细胞的氧化损伤。笔者的实验结果显示，外加维生素E40mg/L于贮存的血液中，使血浆游离血红蛋白明显降低，呈现良好的抗溶血作用；可有效保持SOD活力，减轻超氧化物自由基对细胞的损伤。并可有效的保持ATP浓度，使贮存红细胞保持较好完整性。
附表 维生素E对4℃贮存红细胞作用的结果(±s,n=10)
| 贮存时间 (d) | 红细胞ATP(μmol/gHb) | 游离血红蛋白(mg/L) | 红细胞SOD(Nu/ml) | |||
| 对照组 | VE组 | 对照组 | VE组 | 对照组 | VE组 | |
| 0 | 3.22±0.27 | 3.28±0.32 | 25.3±4.9 | 25.9±3.5 | 2571±130 | 2689±146 |
| 7 | 2.07±0.17 | 2.09±0.25 | 30.1±5.2 | 29.5±5.0 | 1615±143 | 2389±129*** |
| 14 | 1.42±0.29 | 1.39±0.24 | 46.9±14.6 | 33.3±5.9* | 1426±185 | 1801±316* |
| 21 | 0.61±0.08 | 0.72±0.09* | 72.2±3.9 | 45.0±7.4*** | 1018±461 | 1457±222* |
| 28 | 0.24±0.03 | 0.31±0.04*** | 96.1±13.1 | 52.1±6.5*** | 267±184 | 855±525** |
| 35 | 0.11±0.02 | 0.20±0.02*** | 135.4±18.1 | 66.5±11．2*** | 49±55 | 323±190 |
注：VE组与同一天对照组的结果比较 *：P＜0.05；**：P＜0.01；***：P＜0.001 以往关于维生素E对贮存红细胞影响的研究结果不一。Kopec-Szeezak等［8］认为于4℃贮存的ACD血液中加维生素E至60μg/ml，加维生素C至2μg/ml，可以降低贮存红细胞的棘细胞数和减轻溶血，但不能有效地保持ATP浓度。Joseph等［9］在献血者口服维生素E 200mg/d和维生素C 250mg/d，10日后取血贮存，经实验认为口服VE和VC比在贮存血液中直接加入谷胱苷肽能更有效地改善贮存红细胞的活力。而Leonart等［10］的实验结果表明，在贮存血液中外加维生素E至21mg/L对人血液的4℃贮存没有影响。如上实验结果不同的原因，一个重要方面是不同的研究所用的维生素E浓度不同；而且给与维生素E的途径不同，有的让献血者口服，有的直接将其加于贮存的血液中；另外观察指标和所用维生素E剂型的差别等因素，都会影响结果和对结果的正确解释。笔者的实验结果进一步证实了维生素E增强红细胞的抗氧化能力，减轻红细胞贮存过程中膜结构的损伤和功能的改变，并保持红细胞活力的有益作用。从而为进一步对贮存血液的抗氧化研究提供了依据。有关维生素E在贮存血液中的最适宜浓度和给与方式仍需进一步的研究。
参考文献
1，Green walt IJ,Dumaswala UJ.Effect of red cell age on vesicalation in vitro.Br J Heamatal,1988;68:456
2，Lawrence C Woeft.Oxidative injuries to the red cell membrane during conventional blood preservation.Semin Hematol，1989;26(4):307
3，苗 林.维生素E静脉乳剂.中国药学杂志，1989；24(8)：468
4，李玉奎，丛玉隆，刘景汉，等.用生物发光法监测RBC-ATP含量的初步报告.中华血液学杂志，1990；11(8)：423
5，叶应妩，王毓三.全国临床检验操作规程.南京：东南大学出版社，1997；61～62
6，Wood L,Beutle E.Storage of erythrocytes in artificial media.Transfusion,1971;11∶123
7，Wolfe L.The membrane and the lesions of storage in preserved red cells.Transfusion,1985;25∶185
8，Kopec-szeezak J,Grabarczyk M.Protective effects of vitamins Eand C on erythrocytse in blood preserved in ACD solution and stored at 4℃.Haematol,1998;21∶219
9，Joseph A,Robert C.The effect of vitamin C and E on lipid peroxidation in stored erythrocytes.Ann Clin Labsci,1993;23∶51
10，Leonart MS.Effect of vitamin E on red blood cell preservation.Bras J Med Biol Res.1989;22∶85
