RT-PCR技术的进行过程及方法

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录

RT-PCR可以用一步法或两步法的形式进行。在两步法RT-PCR中，每一步都在最佳条件下进行。cDNA的合成首先在反转录缓冲液中进行，然后取出1/10的反应产物进行PCR。在一步法RT-PCR中，在同时为反转录和PCR优化的条件下，反转录和PCR顺次进行。

两种方法

1、反转录酶的选择1、Money 鼠白血病病毒反转录酶

有较强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。最适作用温度为37°。

2、AMV反转录酶

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。最适温度为42°。

2、合成cDNA引物的选择

一步法

用于反转录的引物可视实验的具体情况选择随机引物、Oligo dT 及基因特异性引物中的一种。对于短的不具有发卡结构的真核细胞mRNA，三种都可。RT-PCR引物的选择：

1. 随机引物 适用于长的或具有发卡结构的RNA。适用于rRNA、mRNA、tRNA 等所有RNA的反转录反应。主要用于单一模板的RT-PCR反应。

两步法

2. Oligo dT 适用于具有PolyA尾巴的RNA。（原核生物的RNA、真核生物的rRNA和tRNA不具有PolyA尾巴。）由于Oligo dT要结合到PolyA 尾巴上，所以对RNA样品的质量要求较高，即使有少量降解也 会使全长cDNA合成量大大减少。

3. 基因特异性引物 与模板序列互补的引物，适用于目的序列已知的情况。