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NK细胞活性测定实验——放射性核素释放

2019.4.07

实验方法原理	用放射性核素标记靶细胞，当靶细胞受到破坏时，放射性核素被释放出来，通过测定释放或残留在未被破坏细胞内的放射性核素放射活性，即可计算和推测杀伤细胞的细胞毒活性。常用的放射性核素有51Cr、3H-Dr、125I-UdR等。本实验采用51Cr释放法检测人NK细胞活性。
实验材料	靶细胞
试剂、试剂盒	SDS 生理盐水台盼蓝染色液铬酸钠
仪器、耗材	细胞培养板离心管平皿
实验步骤	一、材料准备 1. 靶细胞制备（1）取传代培养24~48小时对数生长期的K562，用RPMI-1640培养液洗涤2次，用10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度4×10⁶/ml。（2）0.5 ml K562细胞悬液加3.7~7.4MBq（100~200uCi）⁵¹Cr，5%CO₂，37度孵育90分钟，每个15分钟振摇一次。（3）RPMI-1640培养液洗涤3次，洗去未标记的游离⁵¹Cr。（4）10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁵/ml，同时检测细胞的⁵¹Cr标记率，一般要求标记率＞0.1 cpm/cell。（5）如暂时不用，可放置4度保存12小时。 2. 效应细胞制备：淋巴细胞分层液分离人PBMC，10%FCS-RPMI-1640培养液调细胞浓度1×10⁷/ml 二、操作步骤 1. 加样：取上述效应细胞和靶细胞各0.1 ml（E：T=100：1）加入96孔培养板内，3复孔。同时设自然释放对照孔（0.1 ml 靶细胞+0.1 ml 10%FCS-RPMI-1640培养液）和最大释放孔（0.1ml靶细胞+0.1 ml 2%SDS）。37度，5%CO₂孵育4小时。 2. 测定：1000 r/min 离心培养板5分钟，用微量移液器吸出各孔上清0.1 ml，加于计数管内，用γ计数仪测定放射活性cpm值。 3. 计算：根据下式计算51Cr自然释放率和NK细胞毒活性 ^（1）51Cr自然释放率（%）=（自然释放孔cpm值）/（最大释放孔cpm值）×100% （2）NK细胞毒活性（%）=（试验孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）/（最大释放对照孔cpm值-自然释放对照孔cpm值）×100% 展开
注意事项	1. 靶细胞的质量非常重要，用台盼蓝拒染色法检测K562靶细胞的存活率应＞95%。标记后的自然释放率应＜15%。 2. 效靶细胞比率一般选择50~100：1，其自然杀伤率不再呈对数增加，标本用量过大。 3. 由于放射性核素具有毒性，标记的靶细胞不宜放置过久，与效应细胞作用时间也不宜过长，因随时间的延长死细胞增多，自然释放率也随之增高。