甲醛洋菜胶体电泳
实验概要
本实验介绍了甲醛洋菜胶体电泳 (formaldehyde-agarose gel electrophoresis)的操作流程。
实验原理
甲醛是一种常用的RNA 变性剂，进行电泳时所使用的缓冲液为MOPS (3-[N-morpholino] propanesulfonic acid)。由于rRNA 占细胞RNA总量的80~85%，以ethidium bromide 染色后，呈现于胶体上的两个主要RNA色带应该分别是large 与small rRNAs (真核生物为28S 与18S，原核生物为23S 与16S)；散布于small rRNA 附近，呈淡淡smear 的就是mRNAs，这是因为mRNAs 存在量不多，而且长度不一的缘故。长度较短的5S rRNA 及tRNA 等则在胶体下方也以特定色带呈现。
主要试剂
1. 自菌体抽取的RNA (I-1, I-2, U-1, and U-2) 与胞外转录反应所制备的正意股及反意股RNA (#1, #2, #3, and #4)
2. 5×formaldehyde gel running buffer (0.1 M MOPS, pH 7.0; 40 mM sodium acetate; 5 mM EDTA)
3. Formaldehyde gel loading buffer (0.25% bromophenol blue; 0.25% xylene cyanol; 50% glycerol; 1 mM EDTA)
4. Ethidium bromide (1 μg/μL in dH2O/DEPC)
5. dH2O/DEPC
主要设备
1. 65℃恒温水槽
2. 微量离心机
3. Mupid II 迷你电泳槽及铸胶器
4. UV transilluminator
5. 防护面罩
6. 拍立得相机
7. 抽气橱
实验步骤
1. 准备一片1.2%甲醛洋菜胶体：
1) 秤取0.48 g agarose置100 mL血清瓶，加入25 mL dH2O/DEPC。
2) 以微波炉加热溶解的后，微微晃动血清瓶使混合均匀，再移至60℃恒温水槽静置5 min。
3) 将装着agarose 溶液的血清瓶移至抽气橱，加入8 mL 的5× formaldehyde gel running buffer 及7.2 mL 的甲醛，轻轻摇晃血清瓶以便混合均匀。
胶体总体积为40 mL，为了避免agarose 溶液因温度快速下降，很快便凝固，应力求动作迅速，但应避免剧烈摇晃，以免弄出一大堆气泡，影响胶体凝结。
4) 尽速于抽气橱内把混合液倒入胶体铸模，并插入样本梳 (teeth comb)。胶体凝固至少需时30 min。
2. 电泳：
1) 要进行电泳时，把已凝固的洋菜胶体放进电泳槽，并加入适量1×formadehyde gel running buffer。
2) 以50 V 定电压预跑5 min。
3) 依序注入上列8 个RNA 样本，以50 V 定电压进行电泳，待追踪染剂移动至胶体三分的二处时，关闭电源，将胶体移至UV transilluminator box，观察RNA 色带的存在情形，并拍照存证。
注意：这一片胶体往下将用来进行北方转印实验，请小心处置！
注意事项
1. 在进行甲醛洋菜胶体电泳分析时，必须先配制含有甲醛的洋菜胶体，RNA 也必须先以甲醛及formamide 进行变性处理，以确保其二度结构充分被打开。
2. 由于甲醛可能是一种致癌物质，配制胶体及进行电泳分析时都应在抽气橱里小心操作；
3. 含有甲醛的洋菜胶体比较滑溜，容易破裂，在移动胶体时应特别留神。
4. 进行下列实验时请务必戴手套。
