拟南芥转基因植株的鉴定
实验概要
本实验介绍了拟南芥转基因植株的初步鉴定方法,包括:阳性苗的筛选,GUS基因表达分析,组织PCR和RT-PCR分析。
主要试剂
0.2%的Triton X-100,10%的次氯酸钠,含20 mg/L Hygromycin的MS培养基,X-Gluc,75%乙醇,0.25 N NaOH,0.25 N HCl,Buffer ( 0.5 M Tris-HCl,pH 8.0,0.25%NP40),RNase freeDNase (Promega)
主要设备
抽真空泵,培养箱,PCR仪,电泳装置,水浴锅
实验材料
转基因拟南芥种子
实验步骤
1. 拟南芥阳性苗的筛选
1) 将收获的转基因种子用0.2%的Triton X-100浸泡10 min;
2) 用10%的次氯酸钠表而消毒12 min;
3) 灭菌水洗涤3次,每2 min一次;
4) 用水将种子铺在含20 mg/L Hygromycin的MS培养基上,4℃黑暗培养2天;
5) 22℃,16 hr光照培养。经Hygromycin筛选后仍然长势良好,株高高者可初步确定为阳性苗。
2. GUS基因表达分析
将转基因拟南芥植株叶片取样后,加入含有缓冲液和底物(X-Gluc终浓度为0.5 mg/ml)的离心管中,真空抽气使材料完全没入反应液后取出,37℃下染色过夜,经75%乙醇脱色后观察GUS染色情况。
3. 组织PCR
1) 1X1mm的组织,加入40 ul 0.25 N NaOH煮沸30s;
2) 加入40 ul 0.25 N HCl和20 ul buffer ( 0.5 M Tris-HCl,pH 8.0,0.25%NP40)。
3) 煮沸2 min,弃液体部分;
4) 加50 ul PCR反应混合液。
4. RT-PCR分析
取野生型及转基因水稻各株系T2代叶片提取总RNA,经RNase freeDNase (Promega)处理总RNA后,各取2 ug进行反转录。分装,-20℃保存。
根据拟南芥的actin序列设计引物
Araactin 1:5'-TGGTGTCATGGTTGGGATG-3'
Araactin2:5'-CACCACTGAGCACAATGTTAC-3'
分别以引物:
P99:5'atggcgcttgcgggactttatc3'
P224:5'cagttccagtctgaccgaaagc3’
MFS:5'-CGGGGACAGATCATCA-3'
MFA:5'-CATAATGAAATGAAACTA-3’
进行RT-PCR,对目的基因AsPCSl和AsMT2a的表达水平进行检测。