三氟拉嗪对花粉管顶端胞吞胞吐活性和细胞器状态的影响
实验概要
本实验主要应用荧光标记技术、透射电镜技术等手段，分析白杄花粉管中钙-钙调素信号系统受到抑制之后，细胞结构、细胞器分布与状态、胞吞/胞吐以及细胞超微结构等的变化。
主要试剂
1. FM4-64 (Molecular Probes，Inc. Eugene，OR) 用DMSO溶解，配制成200 µM的母液，-20℃避光保存。
2. MiToTracker Red CMXRos (Molecular Probes，Inc. Eugene，OR) 50 µg药品加入94 µL DMSO溶解，配成1 nmol/µL的母液，-20℃避光保存。
主要设备
激光共聚焦显微镜(ZEISS，LSM 510 META)
电子显微镜(JEOL Ltd. Tokyo，Japan)
LKB-V超薄切片机
紫外分光光度计(DU 640; Beckman-Coulter，MD，USA)
实验材料
白杄花粉
实验步骤
1. 材料培养
分别称取10 mg白杄花粉，置于以下两种培养基，25℃条件下摇床(120 rpm)暗中培养20 h。
1) 12%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01% Ca(NO3)2 (CKM)
2) 12%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01% Ca(NO3)2 25 µM TFP
3) 12%蔗糖 0.01%H3BO3 0.01% Ca(NO3)2 50 µM TFP
2. FM4-64的装载及共聚焦显微镜观察
取培养20 h不同处理的白杄花粉管各200 µl，加入5 µl FM4-64母液，立即混匀，使FM4-64终浓度为5 µM。孵育10 s后，将材料加于载玻片上，激光共聚焦显微镜下观察，激发波长488 nm，发射波长514 nm，连续采集图像。
3. 胞吞作用能量依赖性分析
标准培养基培养20 h的花粉管，用500 µM叠氮化钠处理10 min，随即用上述相同浓度的FM4-64标记，按上述操作进行。
4. FM4-64膜专一性标记检测
培养20 h的白杄花粉管用FM4-64标记，1 min后用0.3 M山梨醇处理10 min，使花粉管发生细胞质壁分离，激光共聚焦显微镜下观察并采集图像。
5. 电镜观察
1) 培养20 h的白杄花粉管用0.1 M磷酸缓冲液(pH 7.2)过滤冲洗，收集；
2) 2.5%戊二醛固定4 h；固定液用0.2 M磷酸缓冲液(pH 7.2)配制，并加入2%(w/v)蔗糖；
3) 0.1 M磷酸缓冲液冲洗3-5次，每次0.5 h；
4) 1%锇酸再固定4 h；
5) 0.1 M磷酸缓冲液冲洗3-5次，每次0.5 h；
6) 系列乙醇脱水，环氧丙烷过渡，Spurr树脂包埋；
7) LKB-V超薄切片机切片，切片厚度为75 nm；
8) 2%醋酸双氧铀(w/v)染色40 min；0.5%柠檬酸铅隔绝空气染色30 min；
9) JEM-1230电子显微镜80 kV下观察、拍照。
6. 花粉管微丝的标记
收集不同浓度TFP处理的花粉管，在新鲜配制的4%多聚甲醛(50 mM Pipes buffer，pH 6.9)固定1 h。以50 mM Pipes缓冲液洗涤三次后，在含有1%果胶酶和1%纤维素酶的50 mM Pipes buffer 中于37℃孵育15 min。以50 mM Pipes buffer洗涤三次后，样品再用1%Triton X-100室温渗透40 min。50 mM Pipes buffer洗涤三次后，样品与0.2 nM phalloidin-TRITC暗处共孵育1 h。滴入50%甘油(含抗荧光淬灭剂)，用指甲油封片。激光共聚焦显微镜下观察，Ar/Kr激光，激光波长515 nm。沿Z轴进行连续光学切片，将所有光学切片进行三维重构。
7. 酸性磷酸酶活性测定
酸性磷酸酶活性以每µL样品每分钟水解底物的nmol数来表示。
1) 花粉培养0，6，12，18，24 h时收集培养基；
2) 14，000 rpm 4℃离心30 min；
3) 将上清液与反应缓冲液在30℃共孵育45 min：反应缓冲液用50 mM的乙酸缓冲液配制，其中含有10 mmol/L p-NPP和10 mM MgCl2；
4) 加入100 µL 500 mM的硼酸盐缓冲液终止反应；
5) 用对硝基酚做标准曲线
6) 紫外分光光度计于405 nm波长下测定p-NP浓度。
8. Mitotracker染色观察线粒体分布及状态
收集培养20 h的白杄花粉管，加入MiToTracker Red CMXRos，使终浓度为250 nM，37℃孵育30 min，激光共聚焦显微镜下观察，Ar/Kr激光，激光波长488 nm。
