MLPA方法与遗传疾病检测
MLPA(Multiples ligation-dependent probe amplification)，多重连接依赖探针扩增，是一种在同一反应管内检测多达50个核苷酸序列的拷贝数变化的方法。MLPA可以快速同时鉴定几十个基因的缺失和插入，可用于血液，肿瘤样本的DNA，mRNA的表达谱分析。而且，MLPA方法可用于甲基化分析。MLPA已经证实是可信而可靠的方法，目前已广泛应用于全世界900多个实验室，使用该技术发表的论文已近千篇。
MLPA目前的应用领域：
1.检测小的重排：BRCA1，BRCA2，MSH2，MLH1，DMD，APC，SMA，NF1，NF2，VHL，TSC1/2，MECP2，NSD1，LDLR，FBN1，CFTR，DPYD，COOL5A1，CACNA1A，PKHD1，BRIP1，SLC26A4，LNM1B，PRSS1，FRMD7，TPMT，FLCN，DNAI1，EP300，DNAH5，UBE3A，PCCA，PCDH15等。
2.检测大范围的染色体重排：williams syndrome，prader-willi/angelman syndrome，digeorge syndrome，cri du chat，pelizaeus-merzbacher，CMT1，HNPP等。
3.检测亚端粒区的拷贝数改变。
4.检测染色体非整倍体改变，（包括羊水样本）。
5.肿瘤诊断：ALL，CLL，Oligodendrogliomas，melanomas，neuroblastomas等病的拷贝数改变。
6.甲基化定量检测：Parader-willi、angelman syndrome，beckwith wiedemann，MGMT，MLH1，Fragile X，抑癌基因的失活。
7.mRNA分析细胞凋亡和炎症反应。
MLPA的特点：
1.基于PCR的反应，一个反应同时检测多达50个基因组DNA序列的拷贝数。
2.样本量要求：只需20 ng 人DNA，羊水0.5 ml 约3000个细胞。
3.能区分一个碱基的差异的核酸序列。
4.反应条件优化，所有试剂盒基本适用同一反应条件，试剂盒包含了所有必需试剂。
5.高通量：24小时内得到结果。
6.仪器要求：只需普通PCR仪和测序仪。
7.检测范围：从点突变到大染色体缺失/插入均能检测。
MLPA反应条件（one-tube MLPA protocol）：
1.DNA变性：98度加热5分钟。
2.杂交：加入SALSA探针混合物和buffer于95度孵育1分钟，然后于60度杂交16个小时。
3.连接：加连接酶和buffer于54度孵育15分钟。再于98度加热5分钟使连接酶失活。
4.加引物：dNTP，聚合酶，然后开始PCR扩增。
5.毛细管电泳：输出片段长度和峰面积，软件分析结果。
MLPA的优点：
1.MLPA技术能用于检测许多不同的疾病，差别只是探针不同而已。
2.MLPA是多重反应，一个反应提供了将近50个靶位点。
3.MLPA反应费用较低。
4.MLPA重复性好，简单易操作，可以同时检测多个样本。
5.MLPA敏感性高，仅需20 ng 人DNA，结果不受样品DNA量的影响。
6.MLPA能区分单个碱基的差异，能检测少量的拷贝数改变，如2个，3个拷贝数改变。
7.MLPA可以检测单一外显子的缺失和插入突变。
8.所需仪器易得到
