scFv抗体对RT112细胞表达的FGFR3的活性：使用FACS检测了scFvs和膀胱癌RT112细胞表达的天然FGFR3蛋白的结合活性。如图3A所以，首先检测了6个scFvs噬菌体克隆，6个克隆都可以和膀胱癌RT112细胞发生显著的反应。然后，检测纯化后的4个scFvs蛋白(3B，3C，2D，7D)的结合活性，发现3C和7D可以和RT112细胞发生显著的反应，2D和3B的反应活性相对较弱。使用共聚焦显微镜观察了3C和7D染色的细胞，进一步显示出scFv的膜蛋白染色特征(图3A)。

通过在非变性条件下的免疫沉淀方法进一步证明scFv和FGFR3的亲和特异性。如图3B所示，纯化后的两个scFv（3C和7D）都在正确的位置产生显著的蛋白条件，进一步证明这两个scFv抗体可以识别可溶性的和天然的FGFR3受体。

scFv抗体和FGFR3突变体的反应活性：因为FGFR3在膀胱癌细胞中经常发生突变，所以，也检测了两个scFv抗体和FGFR3 S249C突变体的结合活性，已有报道FGFR3 S249C是在膀胱癌细胞中最经常发生的突变形式。通过PCR方法在FGFR3中引入上面的突变，并通过DNA测序证明突变位点正确(如图4A)。通过western bolt验证转染的HEK293T细胞可以正确表达突变的FGFR3S249C蛋白(如图4B)，并且FGFR3S249C具有和野生型FGFR3WT相类似的表达水平。FACS分析证明两个scFvs 3C和7D都可以识别表达了突变FGFR3蛋白的HEK293T细胞，甚至比表达野生型FGFR3蛋白的细胞的反应活性更强(图4C)。

抑制RT112细胞增殖：我们检测了scFvs在体外抑制RT112肿瘤细胞增殖的有效性。加入三个不同浓度的scFv到RT112细胞，如图5A所示，两个scFv 3C和7D都能够显著抑制细胞增殖，而且抑制效应和加入的抗体浓度成正相关。2umol/L浓度的时候，抑制活性最强，但是在0.2umol/L的时候，仍然具有显著的抑制活性。

除此之外，检测了不同的生长因子对scFvs抑制效应的影响。如图5B所示，scFvs的抑制效应具有蛋白因子特异性。3C和7D都可以抑制由FGF9诱导的增殖，但是，只有7D能够抑制FGF1诱导的增殖。两个scFvs抗体都不能抑制EGF诱导的细胞增殖，此外，加入可溶性的FGFR3蛋白，可以掩盖掉scFv的抑制效果。从形态学上看，3C和7D处理后，细胞形态会发生变化，尤其是7D处理后能明显导致细胞空泡形成(图5C)。

图3.FACS和共聚焦显微镜分析噬菌体、可溶性scFvs蛋白和RT112膀胱癌细胞的结合活性。A. FACS 直方图显示每个scFv克隆的结合活性(粗线)以及背景荧光(灰色)。RT112细胞使用3C 和7D scFvs标记，使用FITC荧光抗体以及DAPI染色细胞。激光共聚焦显微镜下成像显示(绿色)scFvs蛋白结合细胞膜，(红色)DAPI染色细胞核区域。B. RT112细胞裂解液FGFR3 IP分析。A.RT112细胞裂解液；B. 阴性对照；C, scFv3C；D, scFv7D。

图4.筛选到的scFvs和FGFR3突变体胞外区域的反应活性。A.测序显示DNA序列中引入突变：Ser(TCC)249 突变为Cys (TGC)。B. 免疫印迹分析证明野生型FGFR3和突变FGFR3 (S249C) 在HEK293T细胞中的表达。C . F A C S 分析s c F v 蛋白和表达野生型FGFR3及突变FGFR3 (S249C) HEK293T细胞的结合活性。柱状图中：灰色表示阴性对照；黑色线表示FGFR3(IIIc)WT ；虚线表示FGFR3(IIIc)S249C。

图5. FGFR3特异性的scfvs抗体对RT112细胞增殖的抑制。A. 不同浓度的3B, 3C, 2D和7D scFvs抗体对RT112细胞的抑制活性。C. 2 umol/L 3C and 7DscFvs处理细胞后，细胞数目和形态的分析。

讨论

FGFR3是一个受体酪氨酸激酶，通过激活不同的信号通路在细胞生长和肿瘤形成过程中发挥作用。除了膀胱癌，FGFR3在许多类型肿瘤中发生突变和过表达，所以FGFR3能作为一个优秀的有效的治疗的肿瘤靶点。以前的研究表明，可溶性的天然FGFR3的胞外配体结合区域具有抑制细胞增殖的效应，原理就是可以竞争结合配体，减少配体和细胞表面受体结合。抗体片段可能模仿类似的机制来抑制细胞增殖，事实上，许多研究已经表明，3C和7D能够抑制RT112细胞增殖的机理就是抗体片段直接阻止了FGF-FGFR3的相互作用，从而抑制了FGFR3的激活。但是3C和7D结合FGFR3后的解离速度太快(即Koff值太高约

1.22*10-2和6.14*10-2)，Koff的减少，意味着Kd值的增加，即抗体亲和力增加。所以，可以以3C和7D scFv的序列为模板，在此基础上通过CDR区突变或者体细胞突变模仿来进行亲和力成熟。

参考资料

1. Jorge Martínez-Torrecuadrada, Gabriela Cifuentes, Paula López-Serra, et al., Targeting the Extracellular Domain of Fibroblast Growth Factor Receptor 3 with Human Single-Chain Fv Antibodies Inhibits Bladder Carcinoma Cell Line Proliferation. Clin Cancer Res 2005;11:6280-6290.