醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质的原理和操作步骤-2

因此，在电泳时应尽量避免使用具有高电渗作用的支持物。

醋酸纤维薄膜电泳是用醋酸纤维薄膜作为支持物的电泳方法。

醋酸纤维薄膜由二乙酸纤维素制成，它具有均一的泡沫样的结构，厚度仅120微米，有强渗透性，对分子移动无阻力，作为区带电泳的支持物进行蛋白电泳有简便、快速、样品用量少、应用范围广、分离清晰、没有吸附现象等优点。目前已广泛用于血清蛋白、脂蛋白、血红蛋白和同功酶的分离及用在免疫电泳中。

三、器材及试剂：

1．器材

①醋酸纤维薄膜（2×8cm）

②常压电泳仪

③点样器（盖玻片）
④培养皿（染色及漂洗用）

⑤粗滤纸

⑥玻璃板

⑦竹镊

⑧白磁反应板

⑨人血清或鸡血清

2．试剂：

①巴比妥缓冲液（PH8.6，离子强度0.07）：巴比妥2.76克，巴比妥纳15.45克，加水至1000毫升。

②染色液：含氨基黑10B0.25克，甲醇50毫升，冰醋酸10毫升，水40毫升（可重复使用）。

③漂洗液：含甲醇或乙醇45毫升，冰醋酸5毫升，水50毫升。

④透明液：含无水乙醇7份，冰醋酸3份。

四、操作步骤：

1．浸泡：用镊子取醋酸纤维薄膜1张（识别出光泽面与无光泽面，并在角上用铅笔做上记号）放在缓冲液中浸泡20分钟。

2．点样：把膜条从缓冲液中取出，夹在两层粗滤纸内吸干多余的液体，然后平铺在玻璃板上（无光泽面朝上），将点样器先在白磁板上的血清中沾一下，再在膜条一端2—3厘米处轻轻地水平落下并随即提起，这样即在膜条上点上了细条状的血清样品。

3．电泳：在电泳槽内加入缓冲液，使两个电极槽内的液面等高，将膜条平悬于电泳槽支架的滤纸桥上。（先剪裁尺寸合适的滤纸条，取双层滤纸条附着在电泳槽的支架上，使它的一端与支架的前沿对齐，而另一端浸入电极槽的缓冲液内。用缓冲液将滤纸全部润湿并驱除气泡，使滤纸紧贴在支架上，即为滤纸桥。它是联系醋酸纤维薄膜和两极缓冲液之间的“桥梁”。）膜条上点样的一端靠近负极。盖严电泳室。通电。调节电压至160V，电流强度0.4—0.7毫安/厘米膜宽，电泳时间约为60分钟。

4．染色：电泳完毕后将膜条取下并放在染色液中浸泡10分钟。

5．漂洗：将膜条从染色液中取出，置漂洗液中漂洗数次至无蛋白区底色脱净为止，可得色带清晰的电泳图谱。

6．定量：有两种方法

（1）将上述漂净的薄膜用滤纸吸干，剪下各种蛋白质色带，分别浸于4.0ml0.4mol·l-1NaOH溶液中（37℃）5—10分钟，色泽浸出后，比色（590nm）。设各部分的光密度分别为：

（2）把薄膜放在滤纸上用电吹风吹干，待薄膜完全干燥后，浸入透明液中约5—10分钟，取出，平贴于干净玻璃片上，自然干燥或用电吹风冷风吹干，即得背景透明的电泳图谱，可用刀片刮开并从玻板上取下图谱。能用光密度计测定各蛋白斑点。此图谱可长期保存。

用本法测得血清蛋白各组分的正常值为：

白蛋白=67.24%（61.2—74.5%）

α1球蛋白 α2球蛋白 β球蛋白=16.92%（11.2—22%）

γ球蛋白=15.84%（10.4—20.6%）