荧光定量PCR仪的操作流程与结果分析方法
荧光定量PCR仪的操作流程：确立实验方案，样品制备，设计引物及探针，预实验，标准品及标准曲线的建立，定量PCR检测，分析数据。
1、样品的制备
DNA样品，主要是DNA提取，提取的DNA可TE缓冲液溶解后-20度保存；对于RNA样品，抽提RNA后要迅速反转录，将RNA反转录为cDNA，TE缓冲液溶解后可-20度保存。DNA或cDNA样品也不要长期存放，因为在存放过程中会有少量的DNA降解，从而 影响样品中目的基因的含量。对于大量的样品最佳的检测方案是：
根据实际情况安排好每天要提取的样品数量，提取后若是RAN立即进行反转录反应，并且将当天反转录的样品进行定量PCR检测；千万不可先将所有的样品都提取RNA，提取完RNA后再统一反转录，然后在对cDNA样品进行定量检测，千万不要这样做，因为RNA是极不稳定的，哪怕是存放于-80度冰箱，一方面RNA极其容易降解从而影响检测的准确性，另一方面万一实验室的超低温冰箱放生故障造成停机或停电，那所有提取的RNA将会很大程度的降解，对样品造成不可挽回的损失！
最好的安排是：当天提取或反转录的样品，当天就进行定量PCR的检测，最大程度的减少RNA的降解，这样测定的结果才更准确。
2、定量PCR引物及探针的合成
定量PCR所扩增的片段长度一般都不超过300bp，这样才能确保结果更准确；染料法对引物的特异性要求较高，探针法对引物的特异性要求不高，探针法所扩增的片段长度更短，一般都在200bp以下。引物和探针都要进行Blast分析，以避免非特异性扩增。
3、标准品的制备---质粒或纯化后的PCR产物
这一步骤一般在预实验时完成，严格意义上的操作要求将PCR产物切胶后进行胶回收，并进行质粒的连接、转化到感受态大肠杆菌中，质粒在大肠杆菌中增值后提取质粒，并用分光光度计测定含有PCR产物的质粒的OD值，借此来确定质粒的摩尔量，将已知摩尔量的质粒做5倍或10倍的连续梯度稀释，做成质粒标准品，这是准确测定样品中目的基因模板量的定量基础。
现在也有的不做质粒，直接测定纯化后的PCR产物的摩尔量，然后梯度稀释PCR产物，以此来作为标准品。一般做四个标准品左右5-25-125-625-3125，10-100-1000-10000-100000
4、通道的选择及增益的选择
对于任何一款荧光定量PCR仪来说，都有一组或几组激发光和滤光片以及相应的检测器和滤光片，这些就构成了定量PCR仪的通道。不同的发光基团都有相应的激发光和相应的检测器。定量PCR仪从最初的单通道发展到现在的多通道，常用的通道有FAM/HEX/JOE等。可根据自己所用的发光基团来选择相应的通道。
增益（gain），是荧光信号的放大倍数，发光基团的荧光是很微弱的，必须经过适量的信号放大才能被检测，否则，整个扩增曲线的荧光强度非常小，以致无法准确检测。所以在实验前，要选择合适的增益倍数。
5、标准曲线的建立
梯度稀释后，标准品的扩增曲线间距相等，标准曲线上的间距也相等，说明标准曲线建立的很成功，假如间距参差不齐，说明梯度稀释时操作误差太大，建议重新做标准品的梯度稀释，重新做标准曲线，直到扩增曲线之间的间距相等为止。因为这一步直接影响着样品中目的基因原始模板量的准确性。
6、加样时的操作
所有的加样操作要围绕着尽量使反应体系均一化为目的，除了样品外，其他试剂都要进行预混，预混后分装到各个PCR管中，最后加样品，移液器要尽量准确，因为这一步的操作可以说是差之毫厘，谬以千里。
7、阈值的设定
定量PCR反应结束时开始对结果进行分析，此时需要划定阈值，也就是在扩增曲线的指数期划一条直线，这条线就叫阈值线，在阈值线上，所有的样品的荧光值都一致相同，不同的只是所对应的CT值和初始模板量！
阈值的设定要尽量让回归系数最大！
8.熔解曲线分析
熔解曲线（melt分析）是指定量PCR反应结束后让样品继续升温直到PCR产物的双链全部打开，这时由于双链打开，荧光染料不发荧光，这样荧光值会有一个陡然的突降，借以检测PCR产物的特异性，相当于进行电泳检测。因为不同的PCR产物片段其TM值不同，单一的双链DNA其荧光陡降的温度一致，加入含有非特异性扩增产物，那么其荧光陡降的温度不止一个（两个或更多或杂乱无章）。如图：
