羊驼VHH SingleB®纳米抗体快速发现案例分享
纳米抗体（nanobody, Nb），即重链抗体VHH（variable domain of heavy chain of heavy-chain antibody）——骆驼体内存在着天然缺失轻链的重链抗体(heavy-chain antibody, HCAb)，克隆其可变区而得到的只由一个重链可变区组成的抗体，是目前可以得到的具有完整功能的稳定的可结合抗原的最小单位。
纳米抗体和人抗体重链可变区VH结构非常相似，包含三个高变区(hypervariable region, HVR)和其两侧的四个骨架区(framework region, FR)，且其基因同源性达80%~90%。VHH由两个B片层形成支架，三个高变区聚集在一侧参与抗原识别。纳米抗体的抗原结合环的结构组成比普通抗体VH更大，其CDR1和CDR3比VH的更长——人和小鼠VH的平均长度分别只有14和12个氨基酸，而纳米抗体的CDR3长度为16~18个氨基酸。
纳米抗体的常用的制备方法是通过免疫学和基因工程等技术，从骆驼科动物体内分离出重链抗体，提取总 RNA 经反转录获得模板。根据重链抗体保守区域设计引物，经PCR法扩增获得全套重链抗体可变区基因，而后将其克隆至载体，体外表达获得含有多种单价Nb的抗体库。应用特异性抗原从Nb库中经过多次淘选即可得到抗原特异的 Nb。Nb的制备与筛选常用的为噬菌体天然抗体库和抗原倾向性抗体库两类。Nb的亲和力、特异性等分子特征的优劣取决于噬菌体抗体库的库容和多样性两大因素。天然抗体库是从未经免疫的骆驼科动物B淋巴细胞中扩增得到抗体的 V区基因，随后重组到噬菌体中形成的抗体库。如此得到的抗体特异性相对较低，而且只有库容足够大10-10时才可能筛选到高亲和力的抗体。抗原倾向性抗体库的库容量比天然库低，但抗体库中能够识别特定抗原的特异性功能抗体较高，易于筛选到高亲和力的目的抗体。
除了常规的抗体库筛选的方法外，也可以使用单B细胞抗体发现技术进行纳米抗体的制备。单个B细胞抗体制备技术是一种体外克隆和表达单个抗原特异性 B 细胞抗体基因技术，这种方法保留了轻重链可变区的天然配对，具有基因多样性好、效率高、全人源需要的细胞量少等优势。它的主要流程为从免疫动物获取外周血单个核细胞，进行抗原特异性结合B细胞的分选，接着通过PCR扩增技术得到单个B细胞抗体可变区基因，再通过载体构建获得抗体表达，最后进行产物验证。
德泰生物提供羊驼纳米抗体发现服务，使用自主研发羊驼VHH SingleB®快速发现平台，通过流式和DeepLight®平台进行记忆B细胞和浆细胞双筛选，实现全流程90天交付，并承诺交付大量阳性克隆的同时保证抗体多样性。
案例分享
拥有自建羊驼养殖基地，保证项目使用未经免疫羊驼；自研动物免疫方案，可根据抗原类型定制优化免疫方案，提供包括蛋白、多肽、细胞免疫等。
利用B细胞表面标志物，使用流式细胞仪对目标细胞进行分选，最终获得抗原特异性MBC，并分选至96孔板中。
分选出的抗原特异性MBC，经过RT-PCR、及基因特异性PCR，最终获取重链与轻链序列。利用德泰BGE®高通量表达并进行ELISA和FACS功能验证。在筛选后扩增的96个B细胞中，ELISA结合60株，FACS结合57株。57个FACS结合抗体中，序列多样性可达70%以上。
