ICP-MS检测人全血中的汞
金属汞及其化合物主要以蒸汽或粉尘形态经呼吸道进入人体; 因可溶于类脂质, 如与皮肤直接接触时也可经完整皮肤进入体内。汞中毒表现有神经精神症状、口腔炎症表现、汞毒性皮炎、心功能损伤、肾功能损伤等临床表现。目前生物样本中汞的测定方法主要包括原子吸收光谱法(atomic absorption spectroscopy, AAS)、原子荧光光谱法(atomic fluorescence spectroscopy, AFS)、电感耦合等离子体-原子发射光谱法(inductively coupled plasma-atomic emission spectroscopy, ICP-AES)和电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma-mass spectrometry, ICP-MS)。其中AAS检测汞元素操作方便, 成本低, 稳定性好, 是目前临床上常用的检测方法。但是该方法单批次只能检测单一样本形式(液体类、固体类)中的单一的汞元素, 而且单个样本检测时间长, 不能批量上机检测, 从而不能有效节约检测时间。ICP-MS检测具备灵敏度高、线性范围广和多元素同时检测的特点。我们采用盐酸作为基体, 研究ICP-MS检测人全血汞元素的可行性。
材料和方法
一、相关工作液的配制
1.试剂来源
盐酸[分析纯(analytical reagent, AR)]购自江苏强盛功能化学股份有限公司; 硝酸(AR)、双氧水(AR)购自德国默克公司; 超纯水(18.2 MΩ )用美国密理博(Millipore)超纯水仪制备; 调谐液(锂、钇、铈、铊、钴, 10 ng/mL, 批号3-733BD)购自安捷伦公司; ICP-MS汞标准溶液(1 mg/mL, 批号212075014)、ICP-MS铼标准溶液(1 mg/mL, 批号211095099)购自美国AccuStandard公司; 全血汞质控品购自美国Kaulson Laboratories公司(批号HMB293R11& HMB894R0)。
2.调谐液
10 ng/mL调谐液用2%硝酸配制成1 ng/mL调谐工作溶液, 置4 ℃保存备用。
3.内标液
1 mg/mL 铼标准溶液用2%硝酸配制成1 μ g/mL内标工作溶液, 置4 ℃保存备用。
4.汞标准液
1 mg/mL汞标准溶液用2%盐酸配制成0.1、0.5、1.0、2.5、5.0和10.0 ng/mL标准液, 置聚酯瓶中, 4 ℃备用。标准溶液最多使用1周, 及时更换。标准曲线每天绘制。
二、仪器主要参数设置
AGILENT 7500CE型ICP-MS仪(美国安捷伦科技有限公司)。主要工作参数设置:射频功率(radio-frequency power, RF)为1 500 W; 采样深度为8.5 mm; 载气流为0.7 L/min; 补偿气体流量为0.2 L/min; 蠕动泵转速为0.1 r/s; 雾化器温度为2 ℃。MARS5型微波消解仪(美国CEM公司)主要工作参数见表1。
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三、全血消解(全血前处理)
消解罐放入50%硝酸浸泡过夜, 取出消解罐, 用去离子水清洗3次, 倒扣, 放入烘箱中烘干。取100 μ L去离子水, 混合均匀的全血汞质控品及待测全血分别置于烘干的消解罐中, 每个消解罐分别继续加入200 μ L硝酸、200 μ L双氧水和20 μ L盐酸。盖上消解盖, 按次序放入消解盘中按微波消解仪设置好的程序进行消解。消解完成后待消解罐冷却, 加入2%盐酸溶液2 mL稀释待测。
四、定标过程
仪器使用前用调谐液优化仪器工作参数, 使仪器的氧化物干扰< 1.5%, 双电荷干扰< 3%。标准液按以下次序进样:空白(2%盐酸)、0.1、0.5、1.0、2.5、5.0、10.0 ng/mL。同时内标液通过三通阀与进样管混匀进入仪器检测。
取2 mL稀释待测样本溶液置于样本杯中, 在优化仪器状态下检测样本。每9个样本加1个2%盐酸空白, 冲洗管道。
五、方法学评价
1.检测下限的确定
样本的处理过程同全血消解过程。检测11份空白样本, 计算出检测低限(lower limit of detection, LLD), 公式:LLD=x̅平均空白x̅平均空白+3 s空白[2]s空白2。检测低限加3倍标准差(检测限样本)即为生物检测限(biologic limit of detection, BLD), 公式:BLD=LLD+3s检测限样本[2]s检测限样本2。
2.功能灵敏度的确定
在预期检测限附近5份不同浓度的标准液重复性试验测定结果中, 变异系数(coefficient of variation, CV) 为 20%时的最低检测浓度为功能灵敏度。不同浓度的溶液前处理过程同全血前处理过程一样, 上机检测即可。
3.分析测量范围试验
收集全血检测后血汞含量很低的全血(新生儿或幼儿全血), 混合均匀。混合好后的全血平均分成2份, 1份作为低值(L)样本, 另1份加入汞标准溶液, 混合均匀后作为高值(H)样本。按1L、0.95L+0.05H、0.90L+0.10H、0.80L+0.20H、0.60L+0.40H、0.40L+0.60H、0.20L+0.80H、1H的配制方法, 制成8个不同浓度的系列评价样本。样本的前处理过程同全血消解过程一样, 上机检测, 每个样本检测4次, 每检测1次需要加入1个空白。因为汞有吸附作用所以按由低浓度到高浓度检测, 1 d内完成。
4.回收率试验
取随机混合均匀全血1份, 从中吸取相同4份100 μ L全血于消解罐中。每个消解罐依次加入200 μ L硝酸、200 μ L双氧水、20 μ L盐酸。然后第1份加入20 μ L去离子水作为基础样本; 第2份加入100 ng/mL标准溶液20 μ L作为样本1; 第3份加入250 ng/mL标准溶液20 μ L作为样本2; 第4份加入500 ng/mL标准溶液20 μ L作为样本3。盖上消解盖, 依程序进行消解。消解完毕后待冷却, 加入2%盐酸溶液2 mL, 上机检测。
5.精密度试验
将2个水平全血质控品每天和样本同批次消解上样, 共20 d。质控品检测结果可以作为准确度, 20 d(次)质控结果相对标准差作为批间精密度。临床随机混合全血、2个水平全血质控品同全血前处理一样分别消解20份, 1 d内连续检测完成, 全血结果及2个水平全血质控的相对标准差作为批内精密度。
六、血汞参考区间及测定样本
目前, 国内外文献都参考美国环保局(U.S. Environmental Protection Agency, USEPA)制定的0~5.8 μ g/L作为血汞的参考区间。2001年, USEPA颁布了新的水体甲基汞环境质量标准, 这一标准中设定的参考剂量比原来的推荐剂量低30~70倍, 相应的血汞参考浓度为5.8 ng/mL[3], 比原来的参考浓度(200~500 ng/mL)低34~86倍。0~5.8 ng/mL是目前公认的血汞安全范围。USEPA在另外1篇关于美国育龄期妇女血汞浓度和鱼类消费趋势的研究中也以5.8 ng/mL作为血汞参考值[4], 以此统计不同年龄段血汞的超标率(> 5.8 ng/mL)。松原市产妇和新生儿血汞浓度及健康风险研究中也以5.8 μ g/L作为血汞的参考标准[5]。因此, 本实验室的血汞参考区间为0~5.8 μ g/L。
本研究用于血汞测定的36份全血样本从全国0~6岁的健康体检儿童全血样本中随机抽取。
结 果
一、线性方程和检出限
仪器对汞标准溶液自动读值3次, 计算平均值, 标准曲线各浓度信号数值见图1。标准曲线方程为Y=6.967× 10-2X-3.859× 10-4, r=0.999 9, 线性相关良好。
相同条件消解11份空白样本, 检测汞浓度, 得出空白均值及标准差, 计算得LLD为3.862× 10-2 ng/mL, BLD为4.525× 10-2ng/mL, 满足临床检测要求。
取5份不同浓度的标准溶液, 每份进行20次重复检测。1 ng/mL标准品重复检测的CV为18.45%, 最接近20%, 此时检测限样本浓度为1.495 ng/mL。因此, ICP-MS检测全血汞的功能灵敏度为1.495 ng/mL, 满足临床检测要求。见表2。
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二、分析测量范围
8个不同浓度系列样本检测4次, 计算均值, 计算斜率时要减去低浓度空白。平均斜率乘以加入汞的相对量即为预期值。见表3。
以预期值为X、测量均值为Y作散点图, 目测呈一条直线, 见图2。方程为Y=1.03X+0.07, r2=0.999 8, 说明预期值与测量值之间相关性良好; 斜率为1.03, 符合斜率在0.97~1.03之间的要求; 截距为0.07, 与“ 0” 之间无差异。该方法在0.18~13.83 ng/mL范围内呈线性。
三、回收率
低、中、高浓度的回收率为92%~103%。见表4。
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四、准确度及精密度测定
对2个水平的全血质控品进行20 d检测, 高值[(50± 8) ng/mL]和低值[(20± 5) ng/mL]质控品的测定均值分别为51.39和22.22 ng/mL, 相对标准差(稳定性)分别为5%和6%; 全血质控品的准确度及批间精密度均在要求范围内。1 d内完成检测临床随机混合全血及2个水平的全血质控品各20份, 混合全血测定均值为2.051 ng/mL, 相对标准差为(稳定性)4.8%。高、低值质控品的测定均值分别为50.60、21.60 ng/mL, 相对标准差(稳定性)分别为4.4%、4.8%, 全血质控品的准确度及批内精密度均在要求范围内。
五、人全血样本测定
36份血样的全血汞浓度范围为1.931~4.541 ng/mL, 均值为2.690 ng/mL, 相对标准差为20%, 全血汞浓度均在参考区间内, 无异常数据或汞中毒情况。
讨 论
汞具有较强的记忆效应, 易吸附于管道, 导致之后的检测结果偏高, 影响检测结果。ALLIBONE等在待测溶液中加入金溶液, 形成金汞齐, 使汞不容易吸附于管道, 这样既不影响离子化效率, 对检测的灵敏度也不产生影响。有研究表明, 加入的金溶液浓度与样本浓度的比例为20∶ 1~1∶ 1, 可以较好地解决汞的吸附效应。但是正常人全血汞浓度较低, 又经过稀释, 故不需要加入金溶液来降低记忆效应。虽然正常全血的汞浓度量很低, 但是随着仪器检测样本的增多, 汞的记忆效应还是不可忽视的。试验过程中需注意监测异常血汞浓度和长期检测汞的累积效应。为了提高检测结果的准确性和消除汞的记忆效应, 长期检测汞元素时可以通过以下几种方式解决这个问题:(1)加入相当浓度(20∶ 1~1∶ 1)的金溶液; (2)试验样本中增加空白样本用来清洗管道; (3)定期清洗仪器内部管道。这些措施可以降低汞对管道的吸附效应。
本研究结果显示, 使用ICP-MS检测全血汞的生物检出限为4.525× 10-2 ng/mL, 功能灵敏度为1.495 ng/mL, 分析测量范围为0.18~13.83 ng/mL, 在此范围内线性良好(r2=0.999 8), 回收率为92%~103%, 说明在低、中、高3个生物学浓度范围该仪器检测准确度符合要求。低值和高值质控品的20 d测定均值均在质控品定值范围内, 相对标准差(稳定性)分别为6%、5%, 质控结果准确并且批间精密度< 10%。1 d内检测临床随机混合全血相对标准差(稳定性)为4.8%, 低值和高值质控品的测定均值均在质控品定值范围内, 相对标准差(稳定性)分别为4.8%、4.4%, 质控结果准确并且批内精密度< 5%。由此可见, ICP-MS检测全血汞稳定、可靠, 短期检测不加金溶液也能符合检测要求, 可以满足临床的检测需要。
临床上对于一些未知原因的重金属中毒可以采用ICP-MS一起筛查, 大大节约了排查时间和检测时间; 因ICP-MS仪器可以批量上样, 样本量较大时(职业病筛查、科研研究等)也可快速检测; 临床上的其他体液, 如尿液等的检测更加方便(不需要进行前处理), 仅需根据浓度调整稀释倍数或直接上样检测, 这为治疗时监测尿液汞浓度和用药效果提供了依据; 也为临床和流行病学研究职业或非职业重金属暴露人群的重金属水平以及诊断临床上的相关疾病提供了依据。
与其他方法相比, ICP-MS的优点是可以同时检测多种元素(包括其他重金属和必需微量元素), 大大缩短了检测时间, 节约了人力和物力成本, 可以监测中毒元素治疗疗效, 发现治疗过程中必需微量元素的流失, 为临床医生诊疗提供比较全面的元素动态分析。
