实验方法原理 藻酸盐微珠培养基于在软骨细胞藻酸盐悬液中氯化钙的胶凝作用。

试剂、试剂盒 软骨切除培养液生长培养液分离软骨细胞的酶液胰蛋白酶和EDTA混合液藻酸钠溶液胶凝液溶解液

仪器、耗材 无菌磁铁

实验步骤

切除软骨

1. 自膝关节、肩关节和髋关节取软骨。由于胚胎或幼年供体的软骨比成年供体获得较多细胞，较长时间后才衰老，故胚胎或幼年供体的软骨优于成年供体。生后一个月的 Fauve de Bourgogne 兔或新西兰兔较理想。然而，成年人手术切除的髋关节也是软骨细胞的合适来源。

2. 切除软骨之前，用 CDM （软骨切除培养液（cartilage dissection medium，CDM）：Ham’s F12 培养液（In-vitrogen），添加 20 μg/ml 蔡替米星（Sigma）、10 μg/ml 万古霉素（Sigma）和30 μg/ml 头孢他啶（Sigma）。CDM 用于切开关节和切取软骨，也用于酶消化）彻底清洗关节组织。切除软骨越早越好。除去关节处的皮肤、肌和肌腱。仔细切下软骨，不要带上结缔组织。

分离细胞

为了预防软骨变干，在盛有 CDM 的 100 mm 培养皿（未用 TC 处理）内操作。

下列操作程序中使用的酶液量适用于取自一只兔的膝关节和肩关节的软骨，但必须根据切除软骨的多少确定酶液量。

分离软骨细胞的酶液：

(a)0.05%猪胰蛋白酶（Sigma），用 Ham’s F12 配制；

(b)0.3% Ⅰ型胶原蛋白酶（Worthington，CLSI），用 Ham F12 配制；

(c)0.06% 胶原蛋白酶，用 Ham F12配制，加入 10 % FCS。

将 3 种酶液用 0. 22 μm 滤器过滤除菌。

3. 用十字刀片将软骨片切成 1 mm3 小块。

4. 将软骨块移入 30 ml 平底小瓶。

5. 加入 10 ml 0.05% 胰蛋白酶，将小瓶封起来，在室温条件下用适度磁力搅拌消化 25 min 。

6. 组织块沉下后，除去胰蛋白酶液。

7. 加入 10 ml 0.3 % 胶原蛋白酶，将小瓶封起来，在室温条件下用适度磁力搅拌消化 30 min 。

8. 组织块沉下后，除去胶原蛋白酶液。

9. 加入 10 ml 0.06 % 胶原蛋白酶。

10. 将组织块悬液移入 100 mm 细菌培养级培养皿。用 10 ml 0.06 % 胶原蛋白酶浸洗小瓶后，将浸洗液移入培养皿。然后，放入培养箱，在 37°C 和 5 % CO2 的条件下孵育过夜。

11. 将细胞悬液移入 50 ml 离心管，然后用旋涡混合器混合片刻。

12. 用孔径为 70 μm 尼龙滤器（BD Biosciences）滤去消化后残留的组织。

13. 将过滤液离心（400 g，10 min）。

14. 用 20 ml CDM 混悬细胞，然后用血细胞计数板计数。

15. 离心（400 g，10 min）。

包埋细胞 

16. 用 1 ml 藻酸钠溶液混悬细胞，然后逐渐用藻酸钠溶液稀释细胞悬液，直至细胞密度为 2×106 个/ml。逐渐稀释对于获得均一的藻酸盐细胞悬液是有必要的。

藻酸钠溶液：1.25% （W / V）藻酸钠（Fluka），用 20 mmol/L HEPES 和 0.15 mol/L 氯化钠配制

配制方法：

(a)使用加热的搅拌器，将 HEPES 溶入 0.15 mol/L 氯化钠，然后加热至约 60°C；

(b)加入藻酸钠，继续搅拌，直至完全溶解。溶解时间需 2 h 以上；

(c)由于加入酸（盐酸或硫酸）导致不可逆转的沉淀，用 1 mol/L NaOH 仔细调整 pH 至 7.4，但不要超过 7.4。分装溶液后，在121 °C 条件下高压灭菌 10 min。

另一种配制方法：在微波炉内，藻酸钠很快溶入 HEPES 和氯化钠混合液，时间约10 min 。但是，须注意避免烤焦。

17. 通过 21G 针头将细胞悬液滴加入适度磁力搅拌着的胶凝液（102 mmol/L 氯化钙，5 mmol/L HEPES，pH 7.4）中，使藻酸盐聚集 10 min，形成微珠。

18. 用 5 倍容量的 0.15 mol/L 氯化钠将微珠洗 3 次。

19. 将 5 ml 微珠（1×107 个细胞）放入含有 20 ml 生长培养液（DMEM （含 1 μg/L 葡萄糖）和 Ham F12 混合液（1 : 1，V / V )，添加 4 μg/ml 庆大霉素和 10% FCS）的 75 cm2 培养瓶。

20. 在 37°C 以及湿润的 5 % CO2 和 95 % 空气的条件下培养。

使细胞恢复

21. 吸出培养液。

22. 将两倍容量的溶解液（50 mmol/L EDTA，10 mmol/L HEPES，pH 7.4）加在微珠上。

23. 在 37°C 条件下孵育 15 min。

24. 离心（400 g，10 min）。

25. 用含有 0.06% 胶原蛋白酶的生长培养液混悬细胞。

26. 在 37°C 以及湿润的 5 % CO2 和 95 % 空气的条件下，培养 30 min。

27. 离心（400 g，10 min）。

28. 用无血清 DMEM 和 Ham F12 混合培养液混悬细胞，然后用血细胞计数板计数。

29. 离心（400 g，10 min）。

30. 重复操作步骤 28、29，但不计数细胞。

注意事项

1. 须比较各批血清对于软骨细胞生长和分化细胞表型的作用，如通过免疫标记 Ⅱ 型胶原蛋白评价血清的作用。选用一批血清时，应购买几个月的用量，避免经常换用血清。

2. 应将新用的胶原蛋白酶与以前使用的比较，试验分离软骨细胞的有效性。