1.4 % PPLO琼脂培养基的配制

[用途]
分离支原体。
[配法]
牛心(去脂绞碎)250g，氯化钠5g,胰蛋白酶(不含乳糖)2.5g，蛋白胨10g,酵母浸膏1g，琼脂粉14g，蒸馏水1L。
⑴ 牛心消化液配制：取去脂绞碎牛心250g，氯化钠5g及蒸馏水900m1混合；另取胰蛋白酶2.5g，溶解于100ml 5g/L 氯化钠溶液中，然后与上述牛心消化液混合，放置50~60℃水温箱内消化2h，中间不断搅拌，消化后用两层纱布过滤，滤液煮沸5min，用滤纸过滤后，补足水分至原量，然后加酵母浸膏1g，混匀，冷却后调pH至8.0，分装后121℃灭菌15min备用。

⑵ 支原体基础琼脂：取上述牛心消化液(已加氯化钠)lL，加蛋白胨10g和琼脂粉14g，混合后，加热溶解，调pH至7.8~8.0，再加热煮沸，用脱脂棉或绒布过滤，过滤后分装于圆瓶中，每瓶70m1，121℃灭菌15min，备用。
⑶ 250g/L鲜酵母液制备: 食用鲜酵母块250g，加蒸馏水1L，混合后，煮沸2min，用滤纸过滤，滤后置4℃冰箱中过夜，使之沉淀，次日吸取上清液，用150g/L氢氧化钠溶液调pH至8.0，再煮沸1次，冷却后，3000r／min离心45min，吸取上清液，分装于瓶中，121℃灭菌15min，放4℃冰箱中备用，可保存3月。
⑷ 倾注平板：溶解基础琼脂，冷却至80℃左右，每瓶（70ml）内立即加预温在37℃培养箱内的无菌马血清或小牛血清20m1，250g/L鲜酵母浸出液10ml，10g/L乙酸铊溶液2.5m1，青霉素G钾盐溶液(20万U／m1)0.5m1和两性霉素B溶液(5mg/ml)0.1m1；充分混匀后倾注9cm平板，经37℃培养过夜，无菌试验阴性者，存放4℃冰箱备用。
注：
⑴ 乙酸铊是极毒药品，须特别注意安全操作。
⑵ 支原体美蓝琼脂平皿为分离肺炎支原体的选择性平皿，口腔、唾液分泌物中的其它支原体均被抑制生长，肺炎支原体生长为“桑椹状”无色的菌落。
⑶ 支原体传代、移种用0.1%半固体琼脂，配制时除用0.1%琼脂粉外，其它成分与支原体基础培养基相同，但不加两性霉素，此半固体琼脂分装在试管内灭菌备用。传代时将平皿上已选定的支原体菌落用无菌刀片切下一小块，直接移种于半固体管中，置适当的气体环境中，培养3~5天后，可在琼脂小块出现“小岛状”絮片生长物，或呈颗粒状，即次代支原体。
⑷ 支原体传代用液体培养基：其成分与上述支原体半固体琼脂相同，不加琼脂粉和两性霉素B。