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量子点免疫荧光组织化学实验宝典

2021.7.01
一、量子点免疫荧光组织化学原理

量子点免疫荧光组织化学(Quantum Dots based Immunohistochemistry, QD-IHC)又称量子点免疫荧光细胞化学,是根据抗原—抗体特异性结合的原理,用量子点标记特异性抗体作为探针,检测组织或细胞中抗原性物质的一种技术。量子点免疫荧光组化技术主要有直接法和间接法:直接法是以量子点标记一抗孵育标本以检测其中的抗原成分;间接法则先后加入一抗和量子点标记二抗,形成抗原—一抗—二抗复合体以达到检测该抗原的目的,该法因二抗的放大作用而具有更高的敏感性。


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量子点,又称为纳米晶,是一种由II-VI族或III-V族元素组成的纳米颗粒,其粒径介于1~10nm之间。由于电子和空穴被量子限域,连续的能带结构变成具有分子特性的分立能级结构,受激后可发射荧光。它具有以下主要性质:(l)量子点的发射光谱可通过改变量子点的尺寸和化学组分来控制,波长覆盖整个可见光区;(2)量子点具有很好的光稳定性,与最常用的有机荧光材料“罗丹明6G”相比,其荧光强度高20倍,稳定性高100倍以上;(3)量子点具有宽的激发谱和窄的发射谱,可以实现一元激发,多元发射,且多色量子点间不出现光谱交叠;(4)量子点具有较大的斯托克斯位移,可以避免发射光谱与激发光谱的重叠;(5)生物相容性好,量子点经过各种化学修饰之后,可以进行特异性标记;(6)量子点的荧光寿命长。有机荧光染料的荧光寿命一般仅为几纳秒(这与很多生物样本的自发荧光衰减的时间相当),而量子点的荧光寿命可持续数十纳秒(20ns∽50ns),这使得光激发后,大多数生物自发荧光已经衰变,而量子点荧光仍然存在,此时即可得到无背景干扰的荧光信号。

与传统的染料分子相比,量子点具有多种优势,是一种理想的荧光探针。比如可承受多次激发和光发射;持久的稳定性可以让研究人员更长时间地观测细胞和组织;量子点色彩丰富,可观察生物体系的复杂性。量子点特殊的光学性质使得它在生物化学、分子生物学、细胞生物学、基因组学、蛋白质组学、药物筛选、生物大分子相互作用等研究中有极大的应用前景。

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图2 量子点的组成及其性质


二、实验准备:

1. 标本准备

①石蜡包埋组织切片:由病理室常规处理

②冰冻组织切片:由病理室常规处理

③细胞爬片:将无菌盖玻片置于六孔板中,接种细胞,待细胞生长达到60%以上后取出玻片,4%多聚甲醛固定2 h。

2. 试剂准备

①抗体选择

单克隆抗体针对单一表位,具有较高的特异性,但在该表位破坏后将得不到阳性结果;多克隆抗体表位针对多个表位,可避免单克隆抗体的缺点,但是可能出现非特异性杂交。因此,不论选择单克隆还是多克隆抗体,最好同时购买两个货号的抗体,购买抗体时一定要明确是能够做IHC的抗体,抗体说明书上必须有IHC测试结果。如果该分子文献报道较多,可选择文献上常用的经典抗体。

②一抗与二抗

通常一抗有小鼠、大鼠、兔、人和豚鼠等动物源性;常规二抗包括羊抗鼠、羊抗兔、羊抗人、兔抗鼠、兔抗人等。

③量子点QD610nm

QD610nm激发波长为UV<400nm;发射波长610nm。

④其他试剂

二甲苯、无水乙醇、苏木素、中性封片树脂、柠檬酸钠

3. 抗体特异性验证

所有免疫组化抗体均须Western blot验证抗体特异性,并需免疫荧光实验验证抗原定位。

4. 耗材准备

免疫组化笔或者蜡笔、盖玻片、载玻片

5. 溶液配制

①磷酸盐缓冲液(PBS)

10×PBS母液配制

NaCl                                  72 g

Na2HPO4·12H2O              37.3 g

KH2PO4                            4.3g

加蒸馏水至1000 ml,充分混匀贮存。

使用时用蒸馏水10倍稀释,调整pH值至7.3—7.4。

②柠檬酸抗原修复液

抗原修复使用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液,配方如下:

称取柠檬酸10.5 g,溶于500 ml蒸馏水;称取Na2HPO4·12H2O 57.3g,溶于800 ml蒸馏水。分别量取358 ml柠檬酸溶液和642 ml Na2HPO4溶液,充分混匀后调整pH值至6.0,即得2×母液,贮存备用。

③1%盐酸酒精

浓盐酸与75%酒精按照1:99比例混合,充分混匀。

三、量子点免疫荧光组化操作步骤

1. 组织片脱蜡水化

①将组织片依次放入3个装有二甲苯溶液的玻璃缸中浸泡,每缸15 min。

②依次放入2个装有无水乙醇的玻璃缸,每缸5 min。

③依次放入2个装有95%乙醇的玻璃缸,每缸5 min。

④依次放入90%乙醇、85%乙醇、75%乙醇的玻璃缸,每缸2 min,取出。

⑤放入自来水、蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次。

2. 抗原修复

将切片浸入1×柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液中,高压煮沸后继续加热2 min,然后停止加热让切片自然冷却。

注意:抗原修复过度或不足,均会影响最终染色结果。切片骤冷可致脱片,必须自然冷却!

3. 封闭内源性过氧化氢酶

①放入3% H2O2溶液的玻璃缸中,浸泡15 min。

②放入蒸馏水的玻璃缸中清洗,重复3次。

③放入PBS缓冲液的玻璃缸中,浸泡5 min。

4. 抗原抗体反应

①甩去PBS余液,将组织片平辅在湿盒中,加正常山羊血清1滴20 μl(根据组织大小调整用量),28℃放置20 min,甩干。

②直接法:加稀释好的量子点标记一抗;间接法:加稀释好的一抗1滴(20~50 μl,根据组织块大小进行调整),置于湿盒4℃过夜。

③置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5 min,更换PBS缓冲液,同法操作4次,甩干。

④间接法:量子点标记的二抗20~50 μl(根据组织块大小进行调整),放置湿盒,37℃放置20 min。

⑤置PBS缓冲液的玻璃缸中,缓慢振荡清洗5 min,更换PBS缓冲液,同法操作3次,甩干。

5. 荧光显微镜下进行观察

将直接法与间接法荧光染色的切片至于荧光显微镜下观察,选择激发波长为UV<400nm,发射波长为600nm。


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