细胞凋亡中Caspase-3活性的检测
细胞凋亡中Caspase-3活性的检测主要应用于(1)酶的活力测定(2)细胞凋亡指标检测。
实验方法原理 | Caspase家族在介导细胞凋亡的过程中起着非常重要的作用,其中caspase-3为关键的执行分子,它在凋亡信号传导的许多途径中发挥功能。Caspase-3正常以酶原(32KD)的形式存在于胞浆中,在凋亡的早期阶段,它被激活,活化的Caspase-3由两个大亚基(17KD)和两个小亚基(12KD)组成,裂解相应的胞浆胞核底物,最终导致细胞凋亡。但在细胞凋亡的晚期和死亡细胞,caspase-3的活性明显下降。 |
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实验材料 | |
试剂、试剂盒 | |
仪器、耗材 | |
实验步骤 | 1、收集细胞; 2、PBS洗涤; 3、抽提细胞裂解液; 4、蛋白定量; 5、SDS-PAGE电泳,硝酸纤维素膜或PVDF膜转移,5%脱脂奶粉封闭,室温1.5——2h或4°C过夜; 6、Caspase-3多抗或单抗室温反应1——2h或4℃过夜,TBS-T(含0.05% Tween 20的TBS)洗3次,5——10min/次; 7、HRP-标记的羊抗鼠IgG或AP标记的羊抗鼠IgG室温反应1——2h→ TBS-T洗3次, 5——10min/次; 8、ECL显影或NBT/BCIP显色。 展开 |
注意事项 | 1. 整个操作动作要尽量轻柔,勿用力吹打细胞; 2.反应完毕后尽快在一小时内检测。 |
其他 | 1. 结果采用Western blot 分析Procaspase-3的活化,以及活化的Caspase-3及对底物多聚(ADP-核糖)聚合酶[poly(ADP-ribose)polymerase,PARP]等的裂解。 2. 此外还有荧光分光光度计和流式细胞术分析法。 |
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