高效液相色谱法测定咖啡中的咖啡因含量
一、目的要求
1．理解反相色谱的原理和应用。
2．掌握标准曲线定量法。
二、原理
高效液相色谱的分离原理：见理论课教材
高效液相色谱的定性与定量：见理论课教材
高效液相色谱的仪器：见理论课教材
咖啡因又称咖啡碱，属黄嘌呤衍生物，化学名称为1, 3, 7-三甲基黄嘌呤，可由茶叶或咖啡中提取而得的一种生物碱。它能兴奋大脑皮层，使人精神兴奋。咖啡中含咖啡因约为1.2%~1.8%，茶叶中约含2.0%~4.7%。可乐饮料、APC药片等中含咖啡因。其分子式为C8H10O2N4，结构式为：
采用C-18柱反相液相色谱法进行分离，以紫外检测器进行检测，以咖啡因标准系列溶液外标法定量，可测定各类食品、药品中咖啡因的含量。但实际样品成分往往比较复杂，如果直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱寿命。根据咖啡因的极性和酸碱性，采取萃取分离的方法进行前处理，可有效消除共存的干扰物，对提高定量准确度和保护色谱柱都有较大的益处。
三、仪器与试剂
仪器
试剂 1．甲醇（色谱纯）；二次蒸馏水；氯仿(A.R.)；6 mol•L-1盐酸；饱和碳酸钠溶液；咖啡因(A.R.)；咖啡豆（磨成粉状）或速溶咖啡。
2．1000 mg•L-1咖啡因标准贮备溶液；将咖啡因在110℃下烘干1 h。准确称取0.1000 g咖啡因，用氯仿溶解，定量转移至100 mL容量瓶中，用氯仿稀释至刻度。
四、实验步骤
1．按操作说明书使色谱仪正常工作，色谱条件为：
柱温：室温；流动相：甲醇/水 = 60/40；流动相流量：1.0 mL•min-1；检测波长：275 nm
2．咖啡因标准系列溶液：浓度为10.0~100 mg•L-1。
3．样品处理：准确称取0.25 g咖啡粉试样，用30 mL蒸馏水煮沸10 min，冷却后，将上层清夜转移至100 mL容量瓶中，并按此步骤再重复二次，最后用蒸馏水定容至刻度。将上述样品溶液分别进行干过滤（即用干漏斗、干滤纸过滤），收集25.0mL滤液。上述25.0 mL滤液全部转移到125 mL分液漏斗中，，加入6mol/L盐酸2mL，用10mL乙酸乙酯分两次萃取，弃去乙酸乙酯层。水层中再加入饱和碳酸钠溶液5mL，用20 mL乙酸乙酯分三次萃取。将酯层收集于25 mL容量瓶中，用乙酸乙酯定容至刻度。
4．绘制工作曲线：待液相色谱仪基线平直后，分别注入咖啡因标准系列溶液10μL，记下峰面积和保留时间。
5．样品测定：分别注入样品溶液10μL，根据保留时间确定样品中咖啡因色谱峰的位置，记下咖啡因色谱峰面积。
6．实验结束后，按要求冲洗色谱系统，关好仪器。
五、结果处理
1．根据咖啡因标准系列溶液的色谱图，绘制咖啡因峰面积与其浓度的关系曲线。
2．根据样品中咖啡因色谱峰的峰面积，由工作曲线计咖啡中咖啡因含量（用mg•g-1表示）。
六、注意事项
1．液相色谱法先经色谱柱分离后再检测分析，可有效消除共存杂质的干扰。实际样品成分往往比较复杂，如果不先萃取而直接进样，虽然操作简单，但会影响色谱柱寿命。
2．不同牌号的茶叶、咖啡中咖啡因含量不大相同，称取的样品量可酌情增减。
3．若样品和标准溶液需保存，应置于冰箱中。
4. 为保护仪器色谱柱，柱压不可超过25MPa，当柱压达到20MPa时就应适当减小流速；
5. 进样必须使用专用的平头注射器，绝对严禁使用尖头注射器；
6. 进样前应排尽注射器中的气泡，不可将气泡注入色谱系统。
七、思考题
1．试样处理时，两次萃取的目的和原理有何不同？在操作上的要领有什么差异？
2．若标准曲线用咖啡因浓度对峰高作图，能给出准确结果吗？与本实验的标准曲线相比何者优越？为什么？
3．在样品过滤时，为什么要干过滤？干过滤时没有收集全部滤液是否影响实验结果？为什么？
