干细胞的鉴定实验——扫描电镜样品制备方法

2019.4.12

实验步骤	扫描电镜样品制备方法取材取材的要求基本与透射电镜相同，但观察样品面积可大些 [(l-l.5) mm x (3〜5)mm 。清洗组织表面如覆盖有黏液、分泌物 (如气管、肠等) 或有一些杂物 (如胃表面除有分泌物外还有未消化的食物等) 的样品，需经过充分清洗后方可固定，否则将会影响电镜观察。清洗方法：对表面覆盖有杂物的组织，可以先用生理盐水或 P B S 将杂物冲洗掉，再用蒸馏水漂洗两次。对表面有蛋白黏液分泌物的样品，可先用蛋白水解酶作用使之变成易溶于水的颗粒，再用蒸馏水漂洗。固定、脱水与透射电镜样品制备基本相同。注意：为了减少细胞表面结构的收缩，脱水应从低浓度的 3 0 % 乙醇开始，经50%-70%—8 0 % —85%—9 0 % —9 5 % 乙醇，最后到 1 0 0 % 乙醇递增脱水。除 1 0 0 % 乙醇 15min/次外，其他脱水均为 IOmin/次。样品的干燥样品的干燥处理是扫描电镜制样技术的关键，干燥方法有真空干燥法、冷冻干燥法、临界点干燥法和化学干燥法。以前临界点干燥法应用最多，其操作简单，干燥效果也较好，但需要专门的仪器。近几年化学干燥方法应用更为广泛。 1 ) 临界点干燥法物质都是以固体、液体和气体三种状态存在的，在一定的温度和压力下，三种状态可以相互转变。液体 C O 2 在温度 31.5℃ ，压力 72.8 kg/Cm²(lkg/Cm 2≈0.1M P a ) 时界面消失，样品中的水分在 C O 2 液体气化的临界状态环境中得到干燥。操作步骤：样品脱水后经醋酸异戊酯置换，放入 C O 2 干燥仪样品室，注入液体 C O 2至样品室 7 0 % 的容量并加温至 35T ，此时压力达到 110 个大气压， C O 2 气液界面消失，维持一定时间后放出 C O 2 气体。 2 ) 化学干燥方法使用有机溶剂六甲基二硅胺焼 (hexamethyldisilazane， H M D S )，使有机物质中的非活性氢发生酸化反应，提高有机物质的挥发性、溶解性和反应性，迅速除去样品中的水分和前期处理过程中存留于组织中的有机溶剂而使样品干燥。该法不需要任何仪器设备，没有中间环节对样品的影响，具有操作简单、费用低、用时少和干燥效果好的优点。样品制备方法：样品经 100% 乙醇脱水后，进入到 H M D S (I) 和 (II)15 min/次，最后样品在空气中自然干燥。样品如能放置在真空干燥箱内低真空干燥效果会更好。 H M D S 有毒，操作时应注意防护，样品自然干燥要在通风橱内进行。样品的导电处理生物样品大多为不导电或导电不良体， S E M 观察时易产生「滞电现象」而「打火」，从而影响对微细结构的观察。在观察前需要对样品进行导电处理，这样处理后的样品既能增强了其导电性能，又能增加样品发出二次电子的数量，以达到提高电镜图像质量的目的。导电处理最常用的是离子镀膜法，又称离子溅射。在离子镀膜装置中，将样品放于正极，金、铂等金属放在阴极，在 l〇^-1—— l 〇^-2Torr (lTorr= 1.333 22xl0²Pa) 的状态下，增加电压 (1 〇〇〜 3000V )，使残留的气体电离形成「辉光放电」，金属原子受离子的轰击而逸出，并与气体离子反复碰撞，从各个方向进入形貌复杂的样品缝隙和凹陷处，最后在样品表面均匀地覆盖一层金属膜。特殊样品的制备 ⑴ 血细胞 : 先在 lcmx0.5cm 的盖玻片上涂一层 1 % 的 Formvar 膜或血清，待干燥后将一滴血滴到盖玻片上，再用吸管轻轻地将血滴拨平。加入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定lh， 0.075mol/LPBS 清洗 2 次， IOmin/次， 1 % O s 0 4 固定 30 min，蒸馏水洗 lOmin。之后步骤同常规样品制备。 ( 2 ) 培养细胞：先将细胞在 Icm x lcm 大小的盖玻片上培养，停止培养后，用0.075mol/L PBS 漂洗，加入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定 lh 。之后步骤同常规样品制备 (图2.3) 展

实验步骤

扫描电镜样品制备方法

取材

取材的要求基本与透射电镜相同，但观察样品面积可大些 [(l-l.5) mm x (3〜5)mm 。

清洗

组织表面如覆盖有黏液、分泌物 (如气管、肠等) 或有一些杂物 (如胃表面除有分泌物外还有未消化的食物等) 的样品，需经过充分清洗后方可固定，否则将会影响电镜观察。

清洗方法：对表面覆盖有杂物的组织，可以先用生理盐水或 P B S 将杂物冲洗掉，再用蒸馏水漂洗两次。对表面有蛋白黏液分泌物的样品，可先用蛋白水解酶作用使之变成易溶于水的颗粒，再用蒸馏水漂洗。

固定、脱水

与透射电镜样品制备基本相同。

注意：为了减少细胞表面结构的收缩，脱水应从低浓度的 3 0 % 乙醇开始，经50%-70%—8 0 % —85%—9 0 % —9 5 % 乙醇，最后到 1 0 0 % 乙醇递增脱水。除 1 0 0 % 乙醇
15min/次外，其他脱水均为 IOmin/次。

样品的干燥

样品的干燥处理是扫描电镜制样技术的关键，干燥方法有真空干燥法、冷冻干燥法、临界点干燥法和化学干燥法。以前临界点干燥法应用最多，其操作简单，干燥效果也较好，但需要专门的仪器。近几年化学干燥方法应用更为广泛。

1 ) 临界点干燥法
物质都是以固体、液体和气体三种状态存在的，在一定的温度和压力下，三种状态可以相互转变。液体 C O 2 在温度 31.5℃ ，压力 72.8 kg/Cm²(lkg/Cm 2≈0.1M P a ) 时界面消失，样品中的水分在 C O 2 液体气化的临界状态环境中得到干燥。

操作步骤：样品脱水后经醋酸异戊酯置换，放入 C O 2 干燥仪样品室，注入液体 C O 2至样品室 7 0 % 的容量并加温至 35T ，此时压力达到 110 个大气压， C O 2 气液界面消失，维持一定时间后放出 C O 2 气体。

2 ) 化学干燥方法

使用有机溶剂六甲基二硅胺焼 (hexamethyldisilazane， H M D S )，使有机物质中的非活性氢发生酸化反应，提高有机物质的挥发性、溶解性和反应性，迅速除去样品中的水分和前期处理过程中存留于组织中的有机溶剂而使样品干燥。该法不需要任何仪器设备，没有中间环节对样品的影响，具有操作简单、费用低、用时少和干燥效果好的优点。

样品制备方法：样品经 100% 乙醇脱水后，进入到 H M D S (I) 和 (II)15 min/次，最后样品在空气中自然干燥。样品如能放置在真空干燥箱内低真空干燥效果会更好。 H M D S 有毒，操作时应注意防护，样品自然干燥要在通风橱内进行。

样品的导电处理

生物样品大多为不导电或导电不良体， S E M 观察时易产生「滞电现象」而「打火」，从而影响对微细结构的观察。在观察前需要对样品进行导电处理，这样处理后的样品既能增强了其导电性能，又能增加样品发出二次电子的数量，以达到提高电镜图像质量的目的。导电处理最常用的是离子镀膜法，又称离子溅射。在离子镀膜装置中，将样品放于正极，金、铂等金属放在阴极，在 l〇^-1—— l 〇^-2Torr
(lTorr= 1.333 22xl0²Pa) 的状态下，增加电压 (1 〇〇〜 3000V )，使残留的气体电离形成「辉光放电」，金属原子受离子的轰
击而逸出，并与气体离子反复碰撞，从各个方向进入形貌复杂的样品缝隙和凹陷处，最后在样品表面均匀地覆盖一层金属膜。

特殊样品的制备

⑴ 血细胞 : 先在 lcmx0.5cm 的盖玻片上涂一层 1 % 的 Formvar 膜或血清，待干燥后将一滴血滴到盖玻片上，再用吸管轻轻地将血滴拨平。加入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定lh， 0.075mol/LPBS 清洗 2 次， IOmin/次， 1 % O s 0 4 固定 30 min，蒸馏水洗 lOmin。之后
步骤同常规样品制备。

( 2 ) 培养细胞：先将细胞在 Icm x lcm 大小的盖玻片上培养，停止培养后，用0.075mol/L PBS 漂洗，加入 2%——2.5% 戊二醛固定液固定 lh 。之后步骤同常规样品制备 (图2.3)