细胞凋亡检测：形态学特征的检测方法
根据调亡形态学特征的检测方法
一、普通光学显微镜观察方法
1）苏木素－伊红染色（HE染色法）
石蜡组织切片的HE染色
1．取材组织块，经固定后，常规石蜡包埋，4μm切片。
2．切片常规用二甲苯脱蜡，经各级乙醇至水洗：二甲苯（I）5min→二甲苯（Ⅱ）5min→100％乙醇2min→95％的乙醇1min→80％乙醇1min→75％乙醇1min→蒸馏水洗2min。
3．苏木素染色5min，自来水冲洗。
4．盐酸乙醇分化30s（提插数下）。
5．自来水浸泡15min或温水（约50℃）5min。
6．置伊红液2min。
7．常规脱水，透明，封片：95％乙醇（I）min→95％乙醇（Ⅱ）1min→100％乙醇（I）1min→100％乙醇（Ⅱ）1min→二甲苯石碳酸（3：1）1min→二甲苯（I）1min→二甲苯（Ⅱ）1min→中性树脂封固。
2）甲基绿－派诺宁染色法
1．新鲜取材组织固定液中4℃固定3～6小时。
2．直接转入95％乙醇脱水和无水乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。
3．切片经二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化至蒸馏水。
4．置染色液中室温下染片约1h。
5．取出切片，不经水洗，用滤纸吸干多余染液。
6．插入丙酮中迅速分化。
7．转入丙酮二甲苯（1：1）稍洗。
8．二甲苯透明2～3次。
9．中性树胶封固。
3）Giemsa染色
1．收集细胞（1×106），PBS洗1次。
2．用细胞涂片离心机制成细胞涂片。
3．甲醇固定3～5min。
4．入Giemsa稀释染色液15～30min，冬天在37℃温箱中染色。
5．用磷酸盐缓冲液分色，以镜下控制为准。
6．涂片晾干后用中性树胶封片。
4）瑞氏（Wright）染色
1．收集细胞（1×106），PBS洗1次。
2．用细胞涂片离心机制成细胞涂片。
3．甲醇固定3～5min。
4．用Wright液染色2min。
5．入Wright磷酸缓冲液稀释液4～10min，然后用蒸馏水冲洗。此时如果颜色较深，可0.08％醋酸分化数秒钟。
6．直立晾干后，用中性树胶封固。
二、透射电子显微镜观察方法
1）透射电镜样本的取材和固定
培养细胞的取材和固定
1．常规收集帖壁和悬浮细胞，置离心管中离心，800～1000r/min，10min。
2．用0.01mol/L PBS 5ml重悬细胞。
3．将细胞悬液吸入有琼脂空槽的离心管中。
4．离心，2000r/min，15～20min，使细胞成团。
5．小心吸去上清，加入2.5％戊二醛固定液固定细胞团，以免细胞团散开。
6．取出离心管内的琼脂，仔细切下尖槽内含有细胞团的琼脂块。
7．将含细胞的团琼脂块投入含戊二醛固定液的小瓶中，4℃（可长期）保存。
8．用0.1mol/L PBS缓冲液洗1次。
9．1％锇酸后固定30～60min。
三、荧光显微镜观察方法
1）吖啶橙染色法
1．制备活细胞悬液，浓度约为107/ml。
2．取95μl的细胞悬液，加5μl的吖啶橙贮存液混匀。
3．吸一滴混合液点洁净玻片上，直接用盖玻片封片。
4．荧光显微镜选用激发滤片BG 12或BV等，阻断滤片用515nm或SP3。
2）Hoechst33258染色法
1．原代细胞培养，细胞学涂片或细胞甩片机制备的单细胞片。
2．细胞固定液4℃固定5min。
3．蒸馏水稍洗后，点加Hoechst33258染色液，10min。
4．蒸馏水洗片后，用滤纸沾去多余液体。
5．封片剂封片后荧光显微镜观察。
3）Hoechst33342染色法
1．将Hoechst33342加入培养的细胞中，终浓度为10μg/ml 37℃孵育30min。
2．4％的多聚甲醛和培养液以1：3混合，使多聚甲醛的浓度为1％，固定细胞5～10min。
3．固定好后，将细胞悬液涂在载玻片加盖玻片。
4．荧光显微镜激发滤片选用UV激发滤片，阻断滤片为400～500nm。
以上是先将细胞染色后再行固定观察的方法，也可先固定后染色：
1．收集（0.5～3.0）×106个细胞，500～1000r/min，离心5min去上清。
2．PBS洗1次，500～1000r/min，离心5min去PBS。
3．用3％多聚甲醛50μl重悬细胞，室温下固定10min。
4．PBS洗1次，500～1000r/min离心5min去PBS。
5．用15μl的Hoechst33258或33342重悬细胞，终浓度为16μg/ml，孵育15min。
6．取10μl放在玻片上，荧光显微镜下观察，可数500个细胞，计算调亡率。
