共聚焦显微镜使用技巧与心得（一）之 荧光原理篇
工欲善其事必先利其器，想用好共聚焦显微镜光会用操作可不行，那永远不可能成为“共聚焦达人”，要想成为“达人“必先懂得原理，好吧，开始啦。
什么是荧光？
荧光：
荧光现象是物质在光的照射下所产生的发光现象。
首先荧光是一种光致发光现象，荧光物质必须是在光的照射下才能发光。否则就是其他的发光现象而不是荧光。例如夜光物质，夜光表，虽然也需要先用光照射，但离开光照射后它还能继续发光，就不是荧光。这叫磷光。另外一个例子是作western blot时用化学发光，也是发光，但不是荧光。
其次，荧光物质发出的荧光与照射光的色彩不同。准确地说，是荧光物质发光的波长与照射光的波长是不同的。典型的荧光物质是在紫外线照射下能发出黄绿色的荧光。例如钱上的的荧光防伪标记，用紫外线照射后能发黄绿色的光。
所以在使用荧光显微镜的照片，观察绿色荧光样品时，你会看到物镜下照射到样品的光是蓝色的光。观察红色荧光样品时，照射样品的却是绿色的光。但在目镜里却能分别看到绿色与红色的荧光图像。
在荧光显微镜里，使用蓝色光照射样品后，样品发出的绿色荧光与照射样品的蓝色光混在一起，经过一个滤光片，把蓝色的照射光过滤掉，这样在目镜上就只看到绿色的荧光了。
样品发出的荧光，虽然有一种颜色，但它并不是单色光，而是有一定波长分布范围的混合光。具体测量出每个波长下的相对光强，作一条光强-波长的关系曲线，这就是荧光光谱了。或者称之为发射光谱。它反映了这个物质发射的荧光的色彩成分。一般情况下，荧光物质的荧光光谱的波长范围并不会太大，所以它会形成某种明显的颜色。例如绿色或红色或黄绿色。通常这个波长范围是几十个纳米。
在荧光的光谱分布中，当然会有一个波长对应着最强的荧光强度，这个波长就是我们平时所说的荧光的波长，又叫最大发射光波长，通常荧光染料的参数中的荧光波长就是这个波长。荧光物质所发出的光实际上是这个波长上下几十纳米范围之内的。
照射样品的光叫激发光。激发光的波长必须比荧光波长短。这是能量守恒的因素。短波长的光能量高，它只能激发出能量低一点的光。所以理论上只要比荧光波长更短的光就能激发出荧光。发红色荧光的物质，可以用紫外光，蓝光，绿光来激发它发出红色荧光。不过，这其中也是有某个波长的光是效率最高的。能激发出最强的荧光。这个就是最大激发光波长。这也是荧光染料参数中的激发光波长。
荧光染料发出荧光，其色彩与激发光基本上无关。就是说，如果染料是发红色荧光的，你用蓝色光，紫外光，绿色光都能激发出红色荧光，也只能激发出红色荧光。专业点的说法，就是荧光的光谱与激发光无关。荧光光谱是样品发出的荧光在各个波长下的强度分布。其峰值就是最大发射光波长，或者叫最大荧光波长。 各种染料的荧光光谱基本上都是这个形状，一个简单的峰，有个最大波长，宽度大致在几十个纳米。所以荧光虽然不是纯的单色光，但也基本上是一种颜色。
相比荧光光谱，激发光谱就稍微复杂点，一般不会是一个简单的峰，有时候会有几个峰，宽度通常能从紫外到荧光的波长。这个意义就是通常情况下，用什么光来激发是有很大宽容度的。只要波长比荧光波长短，就能激发出荧光来。这就是现在的显微镜，其滤光片系统与以前不同了，以前是激发滤光片与发射滤光片可以分别选择，可以用蓝光激发红光，但现在使用滤光片组，通用的是绿光激发红光，虽然能适应大多数染料，但偶尔遇到一个需要蓝光激发红光的，就没招了。除非另花几千块买个专用滤块。
激发光谱与发射光谱基本上是分开不重迭的，所以通常会把两个光谱画在一个图片上，就成了这个样子的。两条曲线分别对应着激发光谱与发射光谱。
当使用两种染料时，一般是分别拍摄红色与绿色荧光。先使用红色滤块拍摄红色荧光，此时，实际上绿色荧光也会有一点的，滤光片不可能把绿色荧光完全滤掉。拍摄绿色荧光时也一样会有一点红色荧光。 当两个染料的荧光强度差不多的时候，漏过来的一点点其他荧光对图像没啥影响。但是，如果两种染料的荧光强度相差太大时，就有问题了。例如红色荧光强度为1000，绿色荧光强度为1，滤光片过滤效率为1%。当使用绿色滤光片观察时，绿色荧光强度为1，红色的强度为1000X1%=10，漏过来的红光比绿光还要强，这时候，镜下就能看到红色的荧光，这就是串色现象。由此可见，解决串色的办法，就是在制样时把强荧光的染料浓度降一点，让两种色彩亮度平衡。
当两种染料荧光色彩很接近的时候，例如都是绿色荧光，但波长稍有重迭而不是完全重迭，理论上是可以通过拍摄两个波长下的荧光，然后通过计算把两种荧光给分开。现在的光谱型共聚焦显微镜有这个能力。要分别先作两个单染色的样品，分别扫描其光谱，计算出其校正的系数，然后对双染色的样品扫描两个波长下的图片，最后根据系数来对图片进行一些计算，分别得到两个分开的图片。这个功能在实际应用中未必有效，一般来说，两个样的荧光要足够强而且强度要平衡，才能作出有效的计算。如果荧光弱，计算误差会相当大，就得不到好的效果了。
