circRNA在胃癌海绵调控机制的应用（二）

3. hsa_circ_0004872作为分子海绵吸附miR-224
作者首先通过FISH实验观测到hsa_circ_0004872主要分布在细胞质。然后通过RIP-qPCR验证到hsa_circ_0004872与AGO2蛋白结合，pull down实验显示hsa_circ_0004872与miR-224结合。qPCR显示敲降和过表达hsa_circ_0004872可以影响miR-224转录本水平，并且在GC组中miR-224也检测到差异表达。双荧光素酶实验也证实了miR-224可以与hsa_circ_0004872结合。

4. miR-224通过靶向p21和Smad4促进GC细胞增殖、侵袭和迁移
验证了hsa_circ_0004872结合并调控miR-224后，作者接下来验证了miR-224对细胞的影响。EdU和CCK-8实验证实了miR-224促进GC细胞增殖。划痕伤口愈合实验和transwell实验证实了miR-224促进GC细胞侵袭和迁移。对miR-224下游靶基因的研究发现，miR-224可抑制p21 和Smad4基因的转录本和蛋白水平。双荧光素酶实验进一步验证到miR-224结合p21 和Smad4的3’-UTR区。最后，敲降hsa_circ_0004872后验证到了p21 和Smad4的表达受到抑制。

5. 回补实验证明hsa_circ_0004872通过 miR-224产生抑癌作用
作者在过表达hsa_circ_0004872的细胞中转入miR-224，发现可终止hsa_circ_0004872对细胞增殖、侵袭和迁移的抑制作用，同时也会使原本升高的Smad4和p21表达降低。