干细胞的鉴定实验——免 疫 电 镜 胶 体 金 标 记 技 术
| 实验步骤 | 免 疫 电 镜 胶 体 金 标 记 技 术免疫电镜技术是利用抗原抗体特异性结合的原理，在细胞超微结构水平上定位、定性和定量，原位显示抗原大分子的技术。 1971 年 Faulk 等将胶体金标记抗体技术应用到电镜中，开始了免疫电镜胶体金标记技术。该技术的优点是：胶体金颗粒致密，易于辨认 ；定位比酶标记反应物更精确，同时还可以做定量分析；由于金颗粒直径的不同 (适合电镜的金颗粒直径为 5——10n m )，可以在同一切片上分别标记不同的抗体以做双标记或多标记。免疫电镜胶体金标记技术还可以用到冷冻超薄切片、冷冻置换、冷冻蚀刻和扫描 免疫电镜胶体金标记法可以分成包埋前标记法和包埋后标记法。前者由于金颗粒较大 ，对细胞膜的穿透性差，一般只用于细胞表面的抗原表面标记。如果要做细胞内细胞器的定位标记，可 以 用 Triton X -IOO 等活性剂给细胞膜打洞，但是活性剂会破坏细胞的超微结构。目前国外已成功制备了 I n m 金标记的探针，该探针可以穿透组织和细胞，这样就可以标记细胞内抗原。后者主要是进行细胞器的定位标记。包埋前标记法，即样品 包埋后免疫胶体金标记步骤： (1) 将 70n m 超薄切片收集到 3 0 0 目附有 Formvar 支持膜的镍网上。 (2) 准备一个培养皿，内放一张 Parafilm 薄膜。滴 一 滴 8 % 高碘酸溶液在 Parafilm 薄膜 上 ，然后将带有切片的镇网轻轻浮在液面上 (有切片的一面向下)10〜20 min，以达到去锇酸和增进树脂穿透性的目的。 ⑶ 用 0.01m 〇 l/L PBS(pH7. 4) 清洗 3 次 ， 5 min/次，用滤纸吸掉多余的液体。 ⑷ 将 镇 网 浮 于 o. 5% B S A (p H 7. 4) 液滴上 2 〇 min (5) 切片在适当稀释的—抗中孵育， 4℃ 、 24〜 36 h (6) 漂洗同步骤⑶。 (7) 适当稀释胶体金标探针 (可以是二抗_胶体金、40——6dmino 、 蛋 白 A -胶体金等)，室温下孵育 (8) 漂洗同步骤 (6)。 (9) 蒸溜水漂洗 3 次 ， 5 min/次。 (10) 常规醋酸铀、柠檬酸铅染色。 (11) 电镜下观察。 展 |
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