酶切、回收、连接 常识（4）
三．填空题
1．限制酶是一类专门切割 DNA 的酶，它能特异性识别切割 双 链（单、双）DNA。
2．II型限制酶识别位点一般长度为 4~6 个核苷酸对。
3．个体之间DNA限制酶片段长度存在差异称 限制性片段长度多态性（RFLP）。
4．限制酶命名采用Smith和A thens提议的方案，第一个字母大写取自来源细菌的 属名 ；第二、三个字母取自来源细菌的 种名；第四个字母（如果有）取自来源菌的 株系。
5．需要部分酶切时可采取的方法有（1）减少酶的用量 （2）缩短反应时间 （3）增大反应体积。
6．限制酶识别序列为n个碱基，则其切割频率的理论值应是 4n。
7．限制性内切酶通常保存在 50% 浓度的甘油溶液中。
8．甘油浓度是导致一些酶的星活性的原因之一，在酶切时反应体系中的甘油浓度应控制在 5% 以下。
9．限制与修饰是宿主的一种保护体系，它是通过对外源DNA的 限制 和对自身DNA的 修饰 来实现的。
10．II型限制酶既具有 识别位点 的专一性，也具有 切割位点 的专一性。它作用时需要 Mg2+ 离子作辅助因子。
四．简答题
1．在酶切缓冲液中加入牛血清白蛋白（BSA）的目的与机理是什么？
答：目的是保护酶的活性；机理是通过提高反应体系中蛋白质的浓度，防止内切酶失活。
2．如果用EcoR I酶切DNA时出现星活性，试分析原因？
答：主要原因有：酶浓度太高；高PH；低盐；含Mn2+、Cu2+等非Mg2+金属离子；甘油浓度高于5%；存在某些有机溶剂。
3．下列序列中哪些可能是II类限制酶的识别序列？
ATATCG CCCGGG GATATC AGCCGA GAGTC
答：CCCGGG GATATC GAGTC
4．用Klenow酶可将5‘粘末端填补成平末端，而导致某些限制位点消失，下列酶切后用klenow处理再连接不会丢失识别位点的是哪些？
XmaI C↓CCGGG BssH II G↓CGCGC PstI CTGCA↓G
HhaI GCG↓C HpaII G↓CGC
答：BssH II, HpaII
5．当两种限制酶反应条件不同时，若要用双酶切，应采取什么措施？为什么？
答：要避免星活性及部分酶切。（1）先用低盐缓冲液中活性最高的酶切，再补盐和第二种酶；（2）用一种酶消化后，以酚：氯仿：异戊醇抽提，再经乙醇沉淀，将DNA重新溶解与适合第二种酶的缓冲液，加第二种酶消化；（3）先低温酶，后高温酶；（4）使用通用缓冲液。
6．试计算下列三种限制酶各自在某染色体DNA序列上的切割概率
Sau3A I GATC Pst I CTGCAG Hinf I GANTC
Acy I GPuCGPyC
答： 1/44；1/46；1/44；（1/44）x(1/22)
7．一长为4.2kb的DNA片段，分别用EcoRI、PstI及EcoRI+PstI消化，电泳结果如下图所示，请根据结果绘出该片段限制性图谱
0.7kb
0.7kb 0.8kb
1.5kb 1.4kb 2.0kb
2.0kb 2.8kb
EcoRI Pst I EcoRI + Pst I
答： EcoRI PstI EcoRI
0.7kb 0.7kb 0.8kb 2.0kb
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