黄瓜花叶病毒（CMV）的纯化

方法：（黄瓜病叶匀浆粗病毒提取并浓缩后）
Ⅰ. CSCL自形成梯度
用平均密度近1.37的CSCL，（每毫升加0.5克），日立CP100MX离心机，P100AT2转头，6.5PA管，样品量0.5～1ml均匀混在 CSCL中，加满离心管，        78，000rpm ，离心6小时，20℃，加速9减速5。离心后CMV沉降在1.37附近，接近离心管中部，如果在DGF—U用上取法连接带流动池的分光光度计测OD，可得到沿管长分布的OD—管长度曲线，1.37附近的峰就是CMV峰，透析后得纯CMV，CSCL可按下法回收。（见附件）如没有DGF—U（日立自动梯度仪），可用手工做，每管分成50～100管，分别测OD绘曲线图，确定CMV所在的收集离心管。

Ⅱ. Percoll自形成梯度
CMV在Percoll中浮密度大约是1.06～1.065。先用二管试验，P70AT转头，用初密度为1.06的等密度Percoll，［用2.5份Percoll 、7.5份0.25M Sucrose配成Percoll等渗液，每管总量36ml，即Percoll 9ml，进口分装的（sigma）0.25M 蔗糖27ml］，样品2ml混在Percoll梯度液中，100，000xg（31，500rpm），50分钟20℃，加速9，减速5

Ⅲ. CMV在蔗糖中浮密度我不确定，估计在1.15～1.20之间。您可以先制备一个1.05～1.25的密度梯度（先做1.05，1.10，1.15，1.20，1.25，计算容量，静置过夜即可成连续梯度）用P40ST转头，13mlPA管，梯度液约11ml，梯度形成后加样至距管口3mm，200，000xg（33，500rpm），5℃，离心1小时，加速7，减速5。离心后用上取法每管收集成50管，分别测OD，绘成OD—管数曲线，可找到CMV峰并确定它在哪个收集管中。

建议：
1. 你可以看到，如果没有自动梯度仪，你必须每次分别测50～100个样品的OD再绘成曲线根据峰位置确定CMV所在的收集管。如果你有日立DGF—U，再加一个带流动的分光光度计和分部收集器（国产）就可以组成完全自动化的收集线。
2. 做试验前建议先看看我的文章（用户培训的19篇中第2，3，3a及18篇等。搞清楚后再做实验。
3. 以上推荐的方法用于初试，确定了CMV在CSCL，Surcrose，Percoll中的浮密度准确值后可用阶梯梯度进行容量较大的分离（过程简化）
4. 粗离：黄瓜花叶捣碎过滤后，高速离心机8x50ml转头，4，000rpm，5℃，20分，去沉淀，上清液浓缩后加缓冲液用于超离。

附：CsCl回收方法：
   Protocal of recovery of caesium chloride after use ：
1. Starting with about a litre of CsCl gradient solution，extract it six times with an equal volume of acetone.
2. Filter off the crystals and suck dry.
3. Separate the aqueous filtrate from the acetone and heat the remaining aqueous solution in a fume hood with stirring to reduce the volume to about 150 ml.
4. Allow the solution to cool and filter off a second crop of crystals.
5. Combine the first and second crop of crystals and heat them in a silica dish to 600℃ to burn  off all the organic material.
6. Dissolve the CsCl in a minimal amount (4-500ml) of distilled water and filter through Whatman No 54 filter paper to remove the carbon.
7. Concentrate the filtrate by heating in an evaporating dish and when a skin of crystals starts to form on the surface allow the solution to cool.
8. Filter off the crystals and concentrate the filtrate further by repeating Step 7.
9. Filter off a second crop of crystals，discard the filtrate，combine the two crops of crystals，and dry them at 130℃.