造血祖细胞的集落培养
1、集落的种类：
不同细胞来源的集落其形态和大小均有所不同.
2、各种集落的培养步骤：
各种造血细胞集落的培养条件有所不同，但其培养过程大致相似，操作步骤大致如下。
分离所要培养的细胞，制成单个核细胞悬液。
配制相应的培养体系。按比例将细胞因子、营养素以及血清等加入到培养 基中形成特有的培养体系，培养体系最好在37℃水浴中保温10min。
将琼脂等支持物煮沸融化，如是甲基纤维素则不需此步骤，待融化的支持 物温度降到40℃时，加入培养系混匀。
将充分混匀的培养体系加入培养皿或培养板的孔中，一把种3个复孔。
将培养皿或培养板置于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
观察结果，不同的集落计数的时间有所不同，详见下述。
3、粒-单核-巨噬系细胞集落的培养：
以往CFU-GM培养的刺激物多用人白细胞、胎肌以及胎盘裂解液作为条件培养基等，现多用造血生长因子替代。这些细胞因子包括GM-CSF、G-CSF、M-CSF以及IL-3等，但常用GM-CSF。培养基多用IMDM，RPMI等，培养基常用琼脂以及甲基纤维素，但效果前者较好。
培养体系包括20%-30%胎牛血清，50ng/mlGM-CSF，细胞悬液中细胞总数一般以（1-2）X10^5/ml为宜，其余用IMDM或RPMI补齐，但保持琼脂终浓度为0.3%，甲基纤维素终浓度为0.9%-1.0%。细胞一般置于直径为33mm的培养皿或6孔板中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
（1）集落计数 一般培养10-14天观察集落，大于40个细胞的细胞团为一个集落。
（2）集落形态一般CFU-GM的形态分3种。
致密型细胞紧密成团，细胞个体较小，对为粒细胞为主的集落。
混合型细胞团中央为紧密成团的粒细胞，周围弥散分布着单核细胞或巨噬细胞。
松散型细胞团比较均匀地分散，细胞个体较大，多为单核细胞和巨噬细胞组成。
4、红系集落的培养：
（1）集落培养体系CFU-E的培养需要EPO，BFU-E的培养需要PHA-LCM、再生障碍性贫血患者血清或IL-3等，培养基主要为IMDM，几种培养体系见表6-5.
（2）培养方法配制好的体系加入直径为33mm的培养皿或6孔板中，37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养。
（3）集落计数一般CFU-E在培养的第5-7天观察计数，大于8个细胞的细胞团为一个CFU-E集落。BFU-E在培养的第14天计数，大于50个细胞组成的细胞团或3个中心以上的细胞团为一个BFU-E集落。
（4）集落的鉴定在倒置显微镜下，CFU-E及BFU-E集落一般呈鲜红色，易于和其他集落比较。
应用集落染色法进行鉴定。因为红细胞的血红蛋白具有类似过氧化物酶的作用，可使二甲基联苯胺和过氧化氢反应而形成棕红色，借此可与其他集落相鉴别。
首年称取1g二甲基联苯胺，融解于100ml无水乙醇中，配制成1%二甲氧基联苯胺溶液，再配制H2O2工作液，即在0.9ml的蒸馏水中加入0.ml75% H2O2。
染色工作液的配制：每5ml1%的二甲氧基联苯胺溶液中加入H2O2工作液0.2ml并混匀。染色时首先在培养物中加入适量的PBS或生理盐水，10-15min后，加入染色工作液，染色10-15min后，在倒置显微镜下观察计数染色成红色的集落为红系集落。
直接用吸管取出单个集落图片进行鉴定。首先用酒精灯或酒精喷灯在玻璃滴管前端1cm处，加热弯曲成直角，在滴管内吸取少许等渗液，在倒置显微镜下轻轻吸去单个集落，并吹至用多聚赖氨酸处理过的玻片上，轻轻涂开晾干。滴加1%二甲基联苯胺，3min，后滴加3%
H2O2作用1min。蒸馏水漂洗，再用苏木素染色6min，1%盐酸酒精脱色5min，水洗干燥后镜下观察。红系集落染色后胞浆呈橘黄色。也可用单克隆抗体进行酶标鉴定。如应用血型糖蛋白A等。
5、巨核细胞集落的培养：
巨核细胞含量较低，集落不宜鉴别。其集落培养的刺激物只要有TPO、IL-3、IL-6、SCF、PHA-LCM以及再生障碍性贫血患者的血清等。主要培养体系见表6-6.
上述培养体系用培养基补足后加入培养皿或培养板的孔中，于37℃、5%CO2饱和湿度环境下培养7-14天，进行CFU-Meg集落计数，>3个细胞为一个CFU-Meg集落。培养21-24天，进行BFU-Meg集落计数>50个细胞或3个中心以上为一个BFU-Meg集落。集落鉴定：简要介绍应用直接酶标法对血浆凝块法培养的CFU-Meg集落进行鉴定的方法。
在培养皿或培养板的孔的培养物中加入甲醇/丙酮（1：3），固定20min，PBS漂洗，然后室温干燥，不及时染色时可置-20℃保存。
用含2%马血清的PBS室温孵育15min后吸去血清。
滴加10-20ul鼠抗人的IIb/IIIa单抗（一抗），室温孵育1h，PBS漂洗2次。
滴加10-20ul生物素结合的兔抗鼠二抗，室温孵育30min，PBS漂洗2次，
将标本浸于含1%过氧化氢甲醇溶液中，室温孵育1h，以消除内源性过氧化物酶，再用PBS漂洗2次。
滴加ABC试剂，孵育40min后予以充分洗涤。
DBA显色10min，PBS洗2次。
苏木素染色2min，水洗后自然干燥，镜鉴。阳性细胞为棕红色或棕黑色。
6、混合集落的培养：
混合集落是指集落中含有两系、三系和四系细胞的集落，一般是指三系以上的集落。培养方法预计培养体系与BFU-E和CFU-Meg相似，一般于14-18天观察。
7、高增殖潜能集落形成细胞的培养：
HPP-CFC是比较原始的造血祖细胞，在骨髓中含量极低，其生物学特性有以下几点。
可重建受致死剂量照射小鼠的骨髓造血。
具有想粒系、红系、巨核系以及巨噬系等多项分化的能力。
具有抵抗体内外细胞毒药物5-FU的作用。
